生产类胡萝卜素的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用微生物生产类胡萝卜素的生物学方法，所用微生物为Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ（Ｐｈａｆｆｉａ）属微生物，能在抑制剂抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的前提下生产类胡萝卜素。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用微生物生产类胡萝卜素的生物学方法，所用微生物为Xanthophyllomyces(Phaffia)属微生物，能在存在抑制焦磷酸法呢酯(farnesyl pyrophosphate)(此后称为FPP)生物合成甾醇的抑制剂的前提下生产类胡萝卜素。已报道的类胡萝卜素有600多种不同的种类，来自在细菌、酵母、真菌和植物中发现的类胡萝卜素源生物体。现在商业上以微生物生产的只有其中两种，β-胡萝卜素和虾青素，用于食品和饲料业。这些类胡萝卜素作为天然色素以及有益于人体健康的强抗氧化性的功能性物质，具有重要的工业价值。此外，从商业前景来看，对染色剂虾青素的需求在增长，尤其是在养鱼业中，比如鲑鱼养殖，因为虾青素(astaxanthin)使鱼类带鲜明的桔红色而有助于吸引消费者。其它类胡萝卜素，例如番茄红素、玉米黄素、角黄素和β-隐黄素，它们作为天然的色素和抗氧剂也具有重要的工业价值。番茄红素经体外试验显示能有效去除单态氧。番茄红素抑制脂质过氧化作用，其血清水平与发生胰腺癌和子宫癌的危险成反比。水果和蔬菜，例如西红柿、粉红葡萄柚、中的红色、红葡萄皮、西瓜和红番石榴之所以呈红色，都是因为番茄红素。其它膳食资源包括木瓜和杏。玉米黄素是黄色的胡萝卜素，它是一种氧化的β-胡萝卜素羟基衍生物。玉米黄素富含于菠菜、玉米和许多其它植物品种中。这是一种强抗氧化剂，在视网膜中也有发现。公认玉米黄素可以起到过滤器的作用，并能防护来自于眼睛的有害蓝光和抵抗与年龄相关的斑点样退化。角黄素是红色的类胡萝卜素，在许多植物和动物身上都有发现。用于鸡蛋黄、小鸡和养殖的鳟鱼的着色，以及用于要求更显桔红色的食品和化妆品中。角黄素也可起到单态氧的猝灭剂和自由基的灭火剂的作用。β-隐黄素是黄色的类胡萝卜素，存在于桔子、芒果、番木瓜、南瓜和许多其它水果中。β-隐黄素也被认为是一种预防癌症的强抗氧剂。在能大量生产类胡萝卜素的微生物中，法夫红酵母(Phaffiarhodozyma)是一种最为人所熟知的类胡萝卜素源菌株。该酵母菌株产生虾青素，是现在用于供应食品和饲料业所需虾青素的几种微生物之一。在近期的分类学研究中，披露了一种法夫红酵母的雄分生孢子(sexual cycle)，其远距离刺激变形态(telemorphic state)被命名为Xanthophyllomycesdendrorhous。在本申请的描述中，取其众所周知的名称法夫红酵母。为了提高微生物生产类胡萝卜素的水平开展了一些研究，比如，包括使用合适的宿主菌株通过基因工程构造重组微生物使其获得大量生产几种类胡萝卜素的能力，这类菌株有大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母和产朊假丝酵母，改进菌株以获得高产发生器，例如来自法夫红酵母的虾青素的高产发生器，改进方法以获得最佳的发酵工艺，例如已实施的通过法夫红酵母(US5,972,642)生产虾青素的方法。US5,356,809公开了在法夫红酵母细胞中加入抗霉素或另一种主要呼吸链抑制剂提高了虾青素的产出。但该方法并不是特别有效和方便。显然，仍然需要有一个简单有效的方法来提高类胡萝卜素的产率。本专利技术的一个实施方式是生产类胡萝卜素的生物学方法，其中包括有氧条件下在含水营养培养基中培养一种能在抑制剂抑制FPP生物合成甾醇的前提下生产类胡萝卜素的微生物。更优选使用高度类胡萝卜素源微生物，例如属于Xanthophyllomyces(Phaffia)属的微生物。因而，本专利技术所述微生物优选的例子是Xanthophyllomyces(Phaffia)属的微生物。本专利技术优选的Xanthophyllomyces(Phaffia)菌株得自美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209，U.S.A.称为Xanthophyllomyces(Phaffia)ATCC96594(根据布达佩斯条约再次于1998年4月8日保藏，保藏号ATCC74438)。因而本专利技术特别地涉及到一种，其中包括培养一种Xanthophyllomyces(Phaffia)属的微生物在抑制剂抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的前提下生产类胡萝卜素，一种用于有氧条件下在含水营养培养基中生产类胡萝卜素的底物，以及从所述微生物的细胞或从培养基中分离出所得到的类胡萝卜素。尤其是，对于本专利技术所述的生物学方法，更优选抑制甾醇途径的初始反应，该反应由角鲨烯合酶催化。据报道，角鲨烯合酶(在本领域也称作角鲨烯合成酶)抑制剂可以降低细胞的甾醇水平。角鲨烯合酶是一种催化甾醇生物合成甾醇初始关键步骤的酶。两分子的FPP缩合形成角鲨烯。因而，本专利技术的另一个实施例是生产类胡萝卜素的生物学方法，其中包括培养一种能在抑制剂抑制角鲨烯合酶的前提下生产类胡萝卜素的微生物。已报道了几种角鲨烯合酶抑制剂。报道的角鲨烯合酶抑制剂大致有三类，铵离子基角鲨烯合酶抑制剂、含FPP类似物的磷，和羧化物基抑制剂。本专利技术优选任一种角鲨烯合酶抑制剂。这些角鲨烯合酶抑制剂优选的例子之一是铵离子基角鲨烯合酶抑制剂。而且，优选的铵离子基角鲨烯合酶抑制剂之一是苯氧丙胺型角鲨烯合酶抑制剂。已知有很多苯氧丙胺型角鲨烯合酶抑制剂，比如，包括-异丙基-胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-甲基-N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-环戊基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-环丁基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(2-烯丙基-4-丁酰胺基苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-氯-苯氧基)丙胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-丙基苯氧基)丙胺，和N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)-1-甲基丙胺，和其生物学上可接受的盐。本专利技术实施例中所使用的优选的角鲨烯抑制剂包括-异丙基-胺，N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺和N-甲基-N-异丙基-3-(4-乙酰胺基-2-烯丙基苯氧基)丙胺。类胡萝卜素一般通过在培养基中培养一种类胡萝卜素源微生物来进行生产，培养基中包括适合于细胞的常量营养物或微量营养物，如糖蜜、蔗糖或葡萄糖，用作细胞生长的糖源，也作为类胡萝卜素生长的底物，以及氮源如玉米浸渍液、酵母提取物、硫酸二铵、磷酸铵、氨水或脲，磷源如磷酸铵和磷酸和加入的微量营养物或矿物盐如硫酸镁、硫酸锌和生物素或脱硫生物素。进行培养时优选的条件是pH值的范围在4到8之间，且温度范围在15到26℃之间，培养时间24到500小时，更优选的培养条件是pH值的范围在5到7之间，且温度范围在18到22℃之间，培养时间48到350小时。进行培养时，进行通气和搅拌通常会使类胡萝卜素的生产取得良好的结果。在本专利技术中，抑制FPP生物合成甾醇的抑制剂被加入培养基中。相应地，抑制剂的浓度应根据抑制剂和用于生产类胡萝卜素的微生物的种类而改变，比如，浓度范围使得在类胡萝卜素生产条件下细胞生长的减少小于50％。更优选的抑制剂浓度可以是在使细胞生长的减少小于30％浓度范围内。在本专利技术中，抑制FPP生物合成甾醇的抑制剂可以在培养的任何阶段被加入培养基中。按照本专利技术的方法通过培养类胡萝卜素源微生物所生产的类胡萝卜素，可以在被分泌进入培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产类胡萝卜素的生物学方法，其中包括有氧条件下在含水营养培养基中，在存在抑制焦磷酸法呢酯生物合成甾醇的抑制剂下，培养一种能生产类胡萝卜素的微生物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：星野达雄，益田节子，濑户口丰，
申请(专利权)人：DSMIP资产公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]