菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物领域，特别涉及菌株及其应用。提供了预防和/或治疗胡椒瘟病的菌株。平板拮抗试验结果显示，枯草芽孢杆菌VR19对胡椒瘟病菌(Phytophthora capsici)的菌丝生长具有良好的抑制效果。温室盆栽试验结果显示，枯草芽孢杆菌VR19灌根处理后，处理植株的胡椒瘟病发病率及平均病斑面积均有显著降低，防效达68％。遗传转化试验结果显示，枯草芽孢杆菌VR19使用配套的遗传转化方法后，能够被稳定高效的遗传转化，转化效率可达200‑300CFU/μg。

Strain and its application

The invention relates to the field of microorganism, in particular to a strain and its application. A strain to prevent and / or treat pepper blast is provided. The antagonistic test showed that Bacillus subtilis VR19 on pepper blast fungus (Phytophthora capsici) the mycelial growth has good inhibitory effect. Pot experiment results showed that Bacillus subtilis VR19 treatment of root irrigation, processing plants and the average incidence rate of pepper blast lesion area decreased significantly, the control efficiency reached 68%. Genetic transformation experiments showed that the method of supporting the use of genetic transformation of Bacillus subtilis VR19, genetic transformation can be stable and efficient, the conversion efficiency can reach 200 300CFU/ G.

【技术实现步骤摘要】
菌株及其应用
本专利技术涉及微生物领域，特别涉及菌株及其应用。
技术介绍
胡椒瘟病是胡椒上的首要病害。由辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)引起，主要为害胡椒主蔓基部造成植株迅速萎蔫死亡，传播迅速，是一种毁灭性很强的病害。该病害在我国胡椒种植区普遍发生，可造成50％以上的经济损失，严重时可以导致整块胡椒园毁灭。目前，防治胡椒瘟病主要依赖化学农药。但是，化学药剂的大量施用则存在抗药性产生、农药残留和环境破坏等隐患，不符合当前的绿色生态发展的战略。利用生防芽孢杆菌防治胡椒瘟病，具有广谱性好、药效持久、对环境友好等特点，是极佳的绿色防控胡椒瘟病方法之一。目前国内利用生防芽孢杆菌防治植物病害的应用已经十分普遍。在我国目前已登记的135个微生物杀菌剂产品中芽孢杆菌类产品数量的高达83个，但是尚未有防治胡椒瘟病的微生物杀菌剂产品。遗传操作是构建高效基因工程菌株和研究其防病机理的必须手段，对生防菌的开发利用极为重要。但是，天然的野生型芽孢杆菌普遍存在着遗传操作难题，大大限制了人们对生防芽孢杆菌的机理研究和改造利用。目前国内外通常以“Bacillussubtilis168”菌株为对象进行遗传操作及机理研究；但是该菌株于1835年被德国科学家埃伦伯格发现，已经在近200年的人工培养过程中被逐步驯化，一些野生性状出现缺陷突变。近年来，一些野生型芽孢杆菌陆续被报道可以进行遗传操作，例如，“B.subtilis69”、“B.amyloliquefaciensFZB42”、“B.amyloliquefaciensCO6”等。但是这些菌株的依然遗传操作困难，其遗传转化效率均远低于“B.subtilis168”。容易遗传操作的野生型生防芽孢杆菌极为欠缺。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种菌株及其应用。本专利技术的目的共有2点:1)生物防治胡椒产业上危害最大的胡椒瘟病，通过平板拮抗试验和盆栽生防试验，筛选得到对胡椒瘟病防治效果良好的枯草芽孢杆菌VR19，防治效果大于70％；2)建立枯草芽孢杆菌VR19高效遗传操作方法，针对该菌株特性建立了专门的遗传操作方法，遗传转化效率大于200CFU/μg。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了菌株，其保藏编号为CGMCCNO.14450。本专利技术还提供了上述菌株在预防和/或治疗胡椒瘟病的制剂中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述菌株的有效浓度为1×107～5×107CFU/ml，每株胡椒根部浇灌3-5L，每亩浇灌300～500L。本专利技术还提供了上述菌株的发酵方法，其特征在于，将如权利要求1所述的菌株接种于LB培养基，于35～39℃、180～200rpm条件下震荡培养12～16h，制备种子菌；将所述种子菌以3％比例接种于Landy培养基，于28～32℃、150～180rpm条件下发酵培养36～40h。本专利技术还提供了上述发酵方法获得的发酵液。本专利技术还提供了上述发酵液在预防和/或治疗胡椒瘟病的制剂中的应用。本专利技术还提供了一种预防和/或治疗胡椒瘟病的制剂，包括上述菌株或上述发酵液及可接受的辅料。本专利技术还提供了一种预防和/或治疗胡椒瘟病的方法，将上述菌株或上述发酵液浇灌于胡椒根基部，活菌浓度为1×107～5×107CFU/ml；每株胡椒根部浇灌3-5L，每亩浇灌300～500L，每3个月浇灌1次。本专利技术还提供了一种上述菌株的遗传转化方法，将上述菌株依次接种于LB培养基、SPI培养基、SPII培养基培养，收集培养液依次与EGTA、转化用DNA混合培养，离心，收集上清液重悬菌体，涂选择平板。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述遗传转化方法包括如下步骤：步骤1、将所述菌株接种于LB培养基，200rpm37℃震荡培养10～12h；步骤2、取250μl步骤1获得的培养液转接至SPI培养基中，200rpm37℃摇床培养5.5～6.0h；步骤3、取2.8ml步骤2获得的培养液转接至SPII培养基中，于100rpm37℃震荡培养1.5h；步骤4、取步骤3获得的培养液与250μl100×EGTA混合，于100rpm37℃震荡培养10min；步骤5、取步骤4获得的培养液0.5ml与转化用DNA1μg混合，于37℃100rpm震荡培养1～2h；步骤6、50000～10000g离心1～2min，弃除2/3的上清液后重悬菌体，涂选择平板，37℃过夜培养12～16h。本专利技术提供了菌株，其保藏编号为CGMCCNO.14450。生物材料：VR19；分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，已于2017年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本专利技术的优点和积极效果表现在：提供了胡椒瘟病筛选的生防菌株。平板拮抗试验结果显示，枯草芽孢杆菌VR19对胡椒瘟病菌(Phytophthoracapsici)的菌丝生长具有良好的抑制效果(图1)。温室盆栽试验结果显示，枯草芽孢杆菌VR19灌根处理后，处理植株的胡椒瘟病发病率及平均病斑面积均有显著降低，防效达68％(图2、表1)。遗传转化试验结果显示，枯草芽孢杆菌VR19使用配套的遗传转化方法后，能够被稳定高效的遗传转化，转化效率可达200-300CFU/μg(图3、表2)。该生防菌株分离自热带植物香草兰根系，具有高效抑制胡椒瘟病菌的能力，使用后不会产生化学农药残留等一系列问题，椒农可以少用甚至不用化学农药，有利于胡椒绿色有机产品打造，有助于胡椒产业的健康发展及生态环境保护；同时，针对该菌株建立了高效遗传转化操作方法，有助于人们对天然生防枯草芽孢杆菌分子机理研究及高效基因工程菌株构建利用。生物保藏说明生物材料：VR19；分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，已于2017年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNO.14450。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示胡椒瘟病菌在不接种(A)和接种生防菌VR19(B)情况下菌落生长情况；图2示清水对照组叶片(A)和生防菌处理组叶片(B)上平均病斑大小；图3示生防菌VR19转入绿色荧光蛋白编码基因(gfp)后在显微镜下被激专利技术亮的绿色荧光。具体实施方式本专利技术公开了一种菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。生防菌发酵方法：菌种接种于LB培养基中，在35～39℃、180～200rpm条件下震荡培养12～16h制备出种子菌。种子菌以3％比例接种于Landy培养基中，在28～32℃、150～180rpm条件下发酵培养36～40h形成发酵液。生防菌发酵液使用方法：将发酵液稀释10倍形成活菌浓度为1×107～5×107CFU/ml的生防菌处理液，，灌根于胡椒根基部及其周围土壤上。每3个月灌本文档来自技高网...

【技术保护点】
菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.14450。

【技术特征摘要】
1.菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.14450。2.根据权利要求1所述的菌株在预防和/或治疗胡椒瘟病的制剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌株的有效浓度为1×107～5×107CFU/ml，每株根部浇灌3-5L，每亩浇灌300～500L。4.如权利要求1所述菌株的发酵方法，其特征在于，将如权利要求1所述的菌株接种于LB培养基，于35～39℃、180～200rpm条件下震荡培养12～16h，制备种子菌；将所述种子菌以3％比例接种于Landy培养基，于28～32℃、150～180rpm条件下发酵培养36～40h。5.如权利要求4所述的发酵方法获得的发酵液。6.根据权利要求5所述的发酵液在预防和/或治疗胡椒瘟病的制剂中的应用。7.一种预防和/或治疗胡椒瘟病的制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的菌株或如权利要求4所述的发酵液及可接受的辅料。8.一种预防和/或治疗胡椒瘟病的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的菌株或如权利要求4所述的发酵液浇灌于胡椒根基部，活菌浓度为1×107～5×107CFU/ml；每株根部浇...

【专利技术属性】
技术研发人员：高圣风，桑利伟，刘爱勤，苟亚峰，孙世伟，王政，孟倩倩，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院香料饮料研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46