一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂的制备和应用，该菌株已经于2017年9月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养可制备得到液体制剂。本发明专利技术提供的甲基营养型芽孢杆菌B18对黄柏烂皮病有特效，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物所造成的污染环境的严重后果，而且具有可持续、成本低的特点。

Preparation and application of a Bacillus subtilis B18 and its liquid preparation

The invention discloses a Bacillus methylotrophicus B18 and liquid preparation and application of this strain in September 18, 2017 has been preserved in Chinese common culture collection center, the preservation number is CGMCC No.14641. The liquid preparation was prepared by seed culture and fermentation with Bacillus subtilis B18 as a strain. Bacillus methylotrophicus B18 provided by the invention has special effects on phellodendron bark rot, and has good storage resistance, high temperature resistance, low temperature resistance, suitable for the production of dry goods, not only to avoid the serious consequences of environmental pollution caused by chemical drugs, and has the characteristics of low cost, sustainable.

【技术实现步骤摘要】
一种甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂的制备和应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种甲基营养型芽孢杆菌B18菌株及其液体制剂和在黄柏烂皮病防治上的应用。
技术介绍
黄柏是提取小檗碱的主要原料，也是我国重要经济树种和传统皮用类中药材，距今已有2000多年的药用历史，树皮含多种生物碱，有特殊香气与苦味，具有泻火除蒸、泻火解毒、消肿祛腐等功效，是宝贵的药用资源。黄柏皮为临床常用的清热燥湿的中药，用途广泛，市场需求量大，可制成多种中成药，化妆品、生物农药等，对人民的生活健康具有重要价值。此外，黄柏是珍贵的用材树种，木材淡黄色、纹理直且结构细，不翘裂，材质好，坚韧富有弹性，耐水湿、腐性强，易加工，是上等的工业用材。加之其树冠宽阔，树形高大，夏季枝繁叶茂，可形成不错的浓荫效果，也可作为园林树种。广泛栽植不但美化环境，而且活跃经济。其产量主要来自野生资源，近年来由于需求量较大，加之黄柏为多年生木本药材，生长周期较长，药材供不应求。在黄柏的生长过程中易发生烂皮病，表现为枝干产生圆形至椭圆形暗褐色病斑，病部变软呈水渍状，后期因失水而干缩，产生龟裂，严重时造成叶片发黄、脱落、枝干枯死。当林内湿度较大时，树干上有大量橘黄色的丝状物长出，为病菌的分生孢子角。目前，这方面尚无专项研究。目前生产中主要通过营林措施清除病源来进行防治，一般以化学农药、化学肥料为主，但由于长时期施用化学农药(肥料)易污染环境，破坏生态，病害综合防治措施的探讨还有待开展。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术在防治黄柏烂皮病中的缺陷，提供了甲基营养型芽孢杆菌B18及其液体制剂在防治黄柏烂皮病中的应用。本专利技术具体通过以下技术方案实现：本专利技术的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)B18菌株于2016年11月20日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲树皮，已经于2017年9月18日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.14641。本专利技术甲基营养型芽孢杆菌B18在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈白色，圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明。本专利技术甲基营养型芽孢杆菌B18的16SrDNA的序列为：SEQIDNO:1。本专利技术以甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的液体制剂，由甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种，经种子培养、发酵培养得到液体制剂。本专利技术所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种的液体制剂中含活芽孢数不低于1×109cfu/g。本专利技术所述的以甲基营养型芽孢杆菌B18为菌种的液体制剂通过以下方法制备：1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养型芽孢杆菌后，培养制成一级种子；2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体种子；3)液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的10％，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体制剂，然后保存。所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂18g，水1000mL。所述的营养肉质培养液的成分为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl5g，黄柏嫩枝浸渍液1000mL。上述制备方法得到的以甲基营养型芽孢杆菌B18活性成分的液体制剂也在本专利技术保护的范围之内。本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌B18在防治黄柏烂皮病中的应用。本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌B18液体制剂在防治黄柏烂皮病中的应用，将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取液体制剂稀释液对发病部位进行涂抹，间隔7d一次，共5次。所述的液体制剂在治疗松烂皮病中的应用，其液体制剂稀释液为将液体制剂制成浓度为1×109cfu/mL，然后再稀释400倍。当然，本专利技术所述的甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治黄柏烂皮病药物中的应用也在本专利技术的保护范围内。本专利技术甲基营养型芽孢杆菌B18防治黄柏烂皮病的方法也属于本专利技术的保护范围，该方法是在黄柏生长过程中进行涂抹施用；所述涂抹为该甲基营养型芽孢杆菌B18的菌悬液或发酵液或代谢产物或制剂。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的甲基营养型芽孢杆菌B18对黄柏烂皮病有特效，经试验显示对黄柏烂皮病菌的抑制率达到98.36％，将该甲基营养型芽孢杆菌B18制成液体制剂，同样表现有良好的防治效果，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物所造成的污染环境的严重后果，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥的特点，同时符合国家可持续发展的战略，相比化学药物还具有成本低的特点，具有广泛的应用前景。附图说明图1是本专利技术甲基营养型芽孢杆菌B18rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；图2是基于16SrDNA序列构建的菌株B18的系统发育树。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本专利技术的保护范围内。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1甲基营养型芽孢杆菌B18的分离与鉴定1.1内生细菌的分离、纯化与保存在四川大邑仰天窝药场黄柏烂皮病发生区取健康黄柏树皮。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5共5个梯度，分别吸取100μL10-3，10-4，10-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。共获31个内生细菌。1.2内生细菌对黄柏烂皮病病菌的平板拮抗作用平板对峙法：在培养皿中央接种7d的黄柏烂皮病菌(Nectriahaematococca)菌饼(直径6mm)，离该病菌饼约3cm处，分别用接种环沾取培养2d的内生菌，在病菌对称两侧各划一条细线，27℃培养，以只接种病菌的平板为对照，待对照长满皿时测量病菌的菌落生长直本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲基营养型芽孢杆菌B18，其特征在于，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14641。

【技术特征摘要】
1.一种甲基营养型芽孢杆菌B18，其特征在于，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.14641。2.根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌B18，其特征在于，所述的甲基营养型芽孢杆菌B18的16SrDNA的序列为：SEQIDNO:1。3.一种以甲基营养型芽孢杆菌B18为活性成分的液体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种甲基营养型芽孢杆菌后，培养制成一级种子；2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌斜面种子，振荡培养，制成甲基营养型芽孢杆菌液体种子；3)液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种甲基营养型芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的10％，振...

【专利技术属性】
技术研发人员：李姝江，朱天辉，方馨玫，何倩倩，黎肇家，谯天敏，韩珊，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51