在转基因哺乳动物奶中生产融合蛋白的方法技术

从转基因动物的奶中生产和纯化所需的融合蛋白。作为融合蛋白制得肽具有合适的融合配偶体如人α－甲胎蛋白。融合配偶体蛋白促进和提高了整个分子的半衰期以及其自身具有治疗效用。通常通过使用转基因动物来产生融合蛋白且目前可以通过亲和纯化方法从这样动物的奶中或其它体液中纯化出来。通过该途径生产肽的特定优势，除了高产量和生物相容性的明显优势外，是特定的翻译后修饰，如羧基端酰胺化，可以在乳腺中进行。包括与人α－甲胎蛋白片段或其变体融合的治疗活性多肽的生物活性多肽，及其制备方法，编码这样融合多肽的核苷酸序列，包括这样核苷酸序列的表达盒，含有这样表达盒的自我复制的质粒，以及含有所述融合多肽的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有生物活性并可以用于药物学的双功能融合蛋白的生产。特别地，本专利技术提供在转基因哺乳动物奶中尤其是非人胎盘哺乳动物奶中生产与重组人α-甲胎蛋白序列相连的β-干扰素和α-甲胎蛋白融合蛋白序列，并提供了该融合蛋白在治疗应用或病症中的用途。
技术介绍
如上所述，本专利技术总地涉及在转基因动物奶中转基因生产融合蛋白的领域。具体地，涉及产生能够生产各种目标融合蛋白的各种物种的转基因非人哺乳动物的改良方法。目前，存在许多药物学上未能开发的具有一个或多个潜在治疗活性的多肽、大分子和/或蛋白质(“感兴趣的蛋白质”)。对于该无能存在各种原因，如体内的低稳定性、非-真核细胞蛋白质中发现的改变的糖基化模式、不适当的翻译加工、三级结构、脆性结构、免疫原性、工业可接受规模生产的困难性等等。此外，由于与其纯化方法、给药或药物动力学相关的问题，一些治疗上感兴趣的蛋白质在体内没有给出所期望的结果。本专利技术使得克服这些缺陷成为可能。本专利技术提供了新的融合分子，其可以开发感兴趣蛋白质的生理特性或效应。特别地本专利技术起因于以下的证明可以将源自生物活性蛋白质的生理活性序列与由保留人α-甲胎蛋白生理活性的蛋白质序列组成的另一重组蛋白质结构融合来获得双功能融合蛋白，而没有削弱α-甲胎蛋白或其第二个蛋白部分的生物特性。还起因于专利技术者的证明本专利技术的重组人α-甲胎蛋白蛋白序列(“AFP”)可以提高本专利技术融合蛋白的半衰期，以及还增加了协同的治疗效能。现有技术中已经显示了AFP的生理效应包括对各种细胞类型的刺激和抑制效果。这些效果大部分由靶细胞类型、AFP的相对浓度以及其它细胞因子和生长因子的存在来决定。例如，AFP可以抑制多种肿瘤细胞的生长，尤其是，抑制雌激素刺激的或雌激素敏感的细胞的生长。相反地，AFP刺激正常胚胎成纤维细胞的生长。AFP还已经显示了具有免疫抑制和免疫增生效果。因此可以这样利用AFP融合蛋白的治疗效用来最大化各种病况的治疗药理有效性，尤其是使用双功能分子。根据本专利技术的融合蛋白可以在动物体内维持所需的生物活性延长的时间段。还可以通过重组生物体在允许商业开发的水平上分泌表达根据本专利技术的目标蛋白质，如在细胞培养生产设备或转基因哺乳动物中。沿着这条线，转基因哺乳动物对于本专利技术的融合蛋白是优选的生产和表达载体。长期需要具有特定所需特性或特征的哺乳动物，如提高的体重、奶含量、奶生产体积、哺乳间隔的长度和疾病抗性。传统育种方法能够产生具有一些特定所需特性的动物，但是这些特性通常伴随多种非所需的特征，且通常太费时、成本高和发展不可靠。此外，这些方法完全不能够使特定动物系产生基因产物，如所述物种的遗传互补另外完全缺失的所需蛋白治疗剂(即，人或人源化血浆蛋白或有蹄类奶中的其它分子)。能够产生转基因动物的技术发展在生产工程化携带特定特性或设计成表达特定蛋白或其它新的治疗、科学或商业价值的分子化合物的动物中提供了特别精确的方法。即，转基因动物是携带已经在发育早期有意引入现有体细胞和/或种系细胞的目标基因的动物。随着动物的发育和生长，工程化进入动物中的蛋白产物或特定的发育改变得到表达，而且在这一点上存在于该动物及其后代的遗传互补中。本专利技术的优选实施方案中提供了在转基因哺乳动物奶中批量生产目标双功能融合蛋白。在奶中生产目标融合蛋白作为批量生产方法是理想的，因为使用已知的奶场技术可以生产、收集和纯化非常大体积的奶。使用转基因哺乳动物生产方法的第二个优势在于对于人体内生物活性必需的一些反应，例如羧基端酰胺化，通过现有化学方法或在细菌中或其它体外情况中是难以以良好产量来进行的。例如，通过识别并修饰目标融合蛋白或羧基端具有甘氨酸残基的蛋白的特定酶来催化羧基端酰胺化。因此，本专利技术合适设计的融合蛋白可以在分泌进入转基因动物的奶之前得到特异性的酰胺化。这只是可以通过乳腺中的生物合成途径进行并可能用于特定融合蛋白合成的一系列翻译后修饰的一个实例。所需翻译后修饰的其它实例包括二硫桥形成、谷氨酸残基的γ-羧化作用以及O-和N-连接糖基化的加入。关于AFP的生理活性片段，还必须注意重组AFP的非糖基化形式呈现与正常糖基化形式相似的生物特性并由于缺少糖基化的可变性提供了标准化的均一产品。还可以更容易地在体外或转基因系统中生产。因此，非糖基化AFP对于商业生产是优选的形式。根据现有技术，能够生产目标重组蛋白的动物的产生是已知的。然而，在本专利技术之前仍然未知的是本专利技术所需的遗传操纵水平、各种可获得融合蛋白成分的修饰序列、本专利技术双功能分子的协同作用及其在病状或病理学中的用途。因此，存在对治疗组合物改良生产方法的需要。在核移植范围内，本专利技术的方法通常应用于初级体细胞，来产生可用于在它们的奶中生产目标重组融合双功能蛋白的转基因动物。
技术实现思路
简要地说，本专利技术提供了生产所关心的双功能融合蛋白的方法，优选通过使用转基因动物。该方法包括用给定的转基因构建体转染非人哺乳动物细胞系，该构建体含有至少一个编码所需的第一个所需肽片段和第二个所需肽片段的重组DNA编码序列，其中每个片段保留目标单个蛋白的生物活性。该方法包括产生DNA构建体；选择其中所需重组序列已经插入细胞或细胞系基因组中的细胞系；进行核移植程序来产生与所需融合蛋白杂合的转基因动物。此后，可以从转基因动物的奶或其它体液中收集表达双功能融合蛋白的融合蛋白并纯化用作治疗剂。根据本专利技术可以进行的另一步骤是将杂合转基因动物活体切片检查。此后，根据本专利技术，用从杂合动物获得的活体切片检查过的细胞系来体外扩大细胞系，在较短的时间段内产生多个转基因动物。可替换地或另外地，可以进行核移植程序来产生转基因细胞团，用于研究、连续克隆或其它的体外用途。本专利技术的优选实施方案中，通过几种已知的分子生物学方法中的一种来表征存活细胞，这些方法包括但不限于FISH、DNA印迹法或PCR。以上提供的方法可以加速生产与所需转基因纯合的转基因动物畜群并因此更有效地生产所需的生物药物。这样，本专利技术可以生产遗传上所需的自身表达目标双功能融合蛋白的牲畜或非人哺乳动物。此外，本专利技术的方法还可以产生一个或多个携带特别有益或有价值融合蛋白的纯合动物，潜在地提高所需蛋白质的畜群产量，比现有方法更快。同样，本专利技术的方法还提供了替代由于疾病或其自身死亡失去的特定转基因动物。它们还将有助于和促进用各种DNA构建体构建的转基因动物的生产以致最佳化所需生物药物组合物的生产并降低生产成本。因此，根据本专利技术的实施方案，可以用于制造与目标融合蛋白纯合的转基因动物。该实施方案中，优选表征目标转基因和杂合转基因动物的遗传组成。此后，通过使用标记物质来选择与所需转基因纯合的细胞；使用已知的分子生物学方法来表征存活细胞；挑选存活细胞或细胞集落细胞用于第二轮核移植或胚胎移植；和生产与所需融合蛋白纯合的动物。因此本专利技术的一个主题涉及双功能融合蛋白，该融合蛋白含有源自具有治疗活性肽片段的活性部分，该活性部分与人α-甲胎蛋白或人α-甲胎蛋白变体偶联，这两部分具有分开的效果，且在一些情况中具有协同效果。本专利技术的另一主题涉及上述嵌合分子的制备方法。更具体地，该方法包括促使真核或原核细胞宿主表达编码所需融合蛋白的核苷酸序列，且然后收集融合蛋白产物。因此，本专利技术的目的是提供能够治疗重症肌无力的药物。本专利技术的另一目的是提供抑本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过转基因ＤＮＡ构建体编码的双功能融合蛋白，该构建体包括第一个具有所需生物活性的多肽结构域，和第二个具有所需生物活性的多肽结构域，共同组成所述的融合蛋白，其中所述的第一个和所述的第二个多肽结构域各自保留其所需的生物活性，其中所述第一个多肽结构域编码的多肽是人α－甲胎蛋白或其具有人α－甲胎蛋白生物活性的片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H米德，GF考克斯，
申请(专利权)人：GTC生物治疗学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]