多功能纤维素酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新的来自福寿螺的多功能纤维素酶、编码该酶的多核苷酸和经ＤＮＡ重组技术产生这种酶的方法。本发明专利技术还公开了含该多功能纤维索酶的载体和宿主细胞，及其在生产简单糖和葡萄糖方面的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物领域。更具体地，本专利技术涉及一种新的多功能纤维素酶、编码该酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种酶的方法。本专利技术还涉及含该 多功能纤维素酶的载体和宿主细胞及其在生产简单糖和葡萄糖方面的用途。
技术介绍
自上世纪七十年代能源危机以来，国际油价屡创新高，人们逐渐开始寻 找新的可再生燃料来代替石油，燃料乙醇被视为最有可能替代汽油的可再生 能源之一，而其中纤维乙醇燃料的应用前景被广泛看好。植物干物质主要由纤维素和半纤维素构成。纤维素是自然界最丰富的可 再生的能源。将未经任何化学处理的纤维素生物转化成简单糖或葡萄糖，作 为发酵碳源生产酒精，是最理想和有效利用天然纤维素资源的方法之--。纤维素酶是指能将纤维素水解为葡萄糖等简单糖类的一类酶系。通常认为生物转化纤维素生成葡萄糖至少需要三种不同酶的协同作用(l)葡聚糖外切酶(exo-(3-l，4-glucanase， E.C.3.2.9.11)，也称外切纤维素酶(exocellulase)、外 切葡聚糖酶(exoglucanase)、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase， CBH)，作用于 纤维素分子非还原末端水解P-l,4-糖苷键生成纤维二糖和葡萄糖；(2)葡聚糖内 切酶(endo-(3-l，4-glucanase， E.C.3.2丄4)作用于纤维素非结晶区随机水解p-l,4-糖 苷键生成带非还原端的较短的寡聚糖；(3)p-葡萄糖苷酶(p-glucanase, E.C.3.2丄21)将纤维二糖水解为葡萄糖。纤维素的水解反应需要上述三种组分协同作用才能有效地进行。在半纤维素的各种组分中，木聚糖所占比例最大，因此,木聚糖水解酶(木聚 糖酶)也是目前研究最多的半纤维素酶。木聚糖酶同样也是由多种水解酶组成 的酶系。其中，最重要的是内切-卩-l，4-木聚糖酶(endo-卩-l，4-xylanase, E.C.3.2.1.8)和(3-木糖苷酶((3-xylosidase， E.C.3.2丄37)。目前，研究较为集中的是真菌和细菌的纤维素酶系。丝状真菌中的李氏 木霉(T. ree^0和绿色木霉(T.vz力We)以及热纤梭菌(C. Aermoce〃ww)和 ce〃M/o/n卯w y^m'等物种的纤维素酶系较复杂，有多种亚类的内切酶，外切酶 及葡萄糖苷酶，例如绿色木霉有6种亚型的内切酶。热纤梭菌的纤维素酶需要同多个蛋白质形成分子量巨大的 纤维体(Cellulosome)才能起催化反应，显然这样复杂的酶系必然会给研究和 应用带来极大的困难。另一方面，纯化的单一组分的内切酶和外切酶要么不 能水解未经化学处理的天然纤维素生成简单糖，要么水解活力极低,如李氏木 霉(T. ""e/)的纤维素酶系统中至少需14类纤维素酶的协同作用才能水解将未 经化学处理的植物纤维。传统的观点认为动物没有自己的纤维素酶系，需依赖共生菌的纤维素酶 将纤维素水解成单糖，供生命活动需要。但是90年代末发现了白蚁和小龙虾 内在的纤维素内切酶。此外，在拟南芥中也发现了12 种内切酶基因。近年以来，在其他微生物(细菌、放线菌、真菌等)、昆虫、植物、动物中 相继发现了纤维素酶基因。把这些基因克隆到细菌、酵母或昆虫细胞中来构建新的纤维素表达系统成为获得高的纤维素酶产量和活性的方法之一。在地球上每年由固定CO2的光合作用就能形成100亿吨以是上的干植物物质，其中这些物质的组成一半以上是由纤维素，其次是半纤维素(主要由木聚 糖所构成)。如果再加上人类活动所造成的废弃的纤维素，如稻草，麦秸等， 其存在量则要以天文数字来计算。如何釆用生物技术综合利用植物干物质或 废弃的纤维素的问题上，纤维素酶和木聚糖酶(半纤维素酶)起着关键作用。有效地将这些天然的纤维素转化为简单糖是纤维素作为再生能源的关键。目前的纤维素酶还远不能适应将植物纤维素转化为简单糖作为再生能源 的需求。因此，本领域迫切需要开发不同来源的具有能高效率水解纤维素的 新的纤维素酶，以及新的生产葡萄糖的工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种新的多功能纤维素酶以及其片段、类似物和衍 生物，及其编码序列。本专利技术的另一目的是提供生产多功能纤维素酶的方法以及其用途。 本专利技术的另一目的是提供新的生产简单糖和葡萄糖的工艺。在本专利技术的第一方面，提供了新颖的分离出的福寿螺多功能纤维素酶，它包含具有SEQIDNO: 2或4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活 性片段、或其活性衍生物。较佳地，该酶选自下组(a)具有SEQ ID NO: 2或4氨 基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO:2或4氨基酸序列经过一个或多个(例如1-40 个，较佳地1-20个，更佳地1-IO个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的， 且具有内切-e-l，4-葡聚糖酶功能、外切葡聚糖酶功能、和内切-e-i,4-木聚糖酶 功能的由(a)衍生的多肽。本专利技术还提供了一种从福寿螺中直接分离出的多功能纤维素酶，该酶具有 内切-P-l,4-葡聚糖酶功能、外切葡聚糖酶功能、和内切-{3-1，4-木聚糖酶功能。在本专利技术的第二方面，提供编码分离的多功能纤维素酶的多核苷酸，该多 核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少 70%相同性(更佳地至少80%，至少90%相同性)(a)编码上述多功能纤维素酶的 多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有 SEQIDNO:2或4所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下 组的一种(i) 具有SEQIDNO:l中7-1686位的核苷酸序列；(ii) 具有SEQ ID NO: 1中1 -1692位的核苷酸序列；(iii) 具有SEQIDNO:3中56-1738位的核苷酸序列；(iv) 具有SEQ ID NO:3中l-1738位的核苷酸序列。在本专利技术的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转 化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。在本专利技术的第四方面，提供了多功能纤维素酶的制备方法，该方法包含 (a)在适合表达该多功能纤维素酶的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细 胞；(b)从培养物中分离出该多功能纤维素酶。在本专利技术的第五方面，提供了本专利技术多功能纤维素酶、其编码序列、载体 或表达多功能纤维素酶的宿主细胞的用途，它们被用于生产简单糖的工艺。较 佳地，所述的简单糖是纤维二糖、葡萄糖及其混合物。更佳地，所述的简单糖 是葡萄糖。最佳地，利用如稻草等植物干物质为原料。在本专利技术的第六方面，提供了一种新的生产简单糖(如葡萄糖)的工艺，包 括步骤(a)用本专利技术上述的多功能纤维素酶或转化或转导的宿主细胞处理纤维素材料，从而产生简单糖；(b)分离出所述的简单糖。较佳地，所述的纤维素材料是未经任何化学预处理的纤维素材料。本专利技术的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显 而易见的。附图说明图1显示了EGX的组织纯酶电泳图。其中，泳道l. EGX组织纯酶；泳道 2.低分子量蛋白标准品。图2显示了不同pH值对EGX活性的影响。用50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲 体系，在100mM NaCl存在下，测定pH值对EGX水解活性的影响。(A)为羧甲 基纤维素钠水解活性；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多功能纤维素酶，其特征在于，它选自下组：（ａ）具有ＳＥＱＩＤＮＯ：２或４氨基酸序列的多肽；（ｂ）将ＳＥＱＩＤＮＯ：２或４氨基酸序列经过１－１０个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有内切－β－１，４－葡聚糖酶功能、外切葡聚糖酶功能、和内切－β－１，４－木聚糖酶功能的由（ａ）衍生的多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵辅昆，丁明，许根俊，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]