用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法技术

本发明专利技术涉及用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法。该方法的特征在于以下步骤：a)在摩尔渗透压浓度不高于200mOsm/l的水性介质中制备由至少一种基质物质制成的囊泡，其中所述基质物质选自两亲性脂质和两亲性嵌段共聚物；b)将所述囊泡转移到摩尔渗透压浓度比步骤a)中水性介质的摩尔渗透压浓度高至少200mOsm/l的碱性或酸性缓冲液中，以向所述囊泡施加渗透冲击并获得缓冲液填充囊泡；以及c)通过添加中和溶液来稀释包含所述缓冲液填充囊泡的所述水性介质与所述碱性或酸性缓冲液的混合物，以获得悬浮在悬浮缓冲液中的跨膜pH梯度囊泡，其中所述悬浮缓冲液与所述碱性或酸性缓冲液的pH值不同。

A method for the preparation of transmembrane pH gradient vesicles

The present invention relates to a method for preparing a transmembrane pH gradient vesicle. The method is characterized by the following steps: a) in Moore osmotic aqueous medium pressure concentration is higher than that of 200mOsm/l in the preparation by at least one matrix material made of vesicles, wherein the matrix material selected from the group consisting of two amphiphilic lipids and two amphiphilic block copolymer; b) the vesicles transferred to Moore osmotic concentration ratio of step a) Moore medium osmotic pressure water alkaline high concentration of at least 200mOsm/l or acidic buffer, to the vesicle applied osmotic shock and buffer filled vesicles; and C) by adding the neutralized solution containing the mixture to dilute slowly filling the flushing water medium vesicles with the alkaline or acidic buffer, the transmembrane pH gradient to obtain capsule suspended in suspension buffer in the foam, wherein the suspension buffer with the alkaline or acidic buffer solution with different pH value.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法本专利技术涉及根据权利要求1前序部分的用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法，涉及根据权利要求13前序部分的跨膜pH梯度囊泡，以及涉及根据权利要求14前序部分的这样的跨膜pH梯度囊泡的用途。最近，具有远程负载能力(例如跨膜pH梯度脂质体)的囊泡(例如脂质体)的静脉内(Forster等，Biomaterials2012；33：3578-3585)或腹膜内(Forster等，SciTranslMed2014；6：258ra141)施用已被描述为治疗药物过量和内源代谢物中毒(例如高血氨症)的有吸引力的方法。这些脂质体具有内部隔室，其包含酸性或碱性缓冲剂，并且允许通过在内部隔室与外部环境之间存在pH梯度来以其电离态隔离有毒化合物。根据现有技术，通常如下制备跨膜pH梯度脂质体：在酸性或碱性介质中水合，然后滴定(Nichols和DeamerBiochimicaetBiophysicaActa1976；455：269-271)，通过凝胶过滤(Mayer等，BiochimicaetBiophysicaActa1985；816：294-302)或透析(Forster等，Biomaterials2012；33：3578-3585)进行介质交换，然后快速用于封装药物。根据现有技术，在包含封装的化合物的最终制剂上进行对这些囊泡的灭菌。然而，如果要长时间维持跨膜pH梯度(如在生物解毒剂的情况下)和/或如果在高温下对脂质体进行灭菌，则这种方法并不合适。实际上，由于化学物质跨脂质体膜扩散和/或脂双层的脂质组分(主要是磷脂)的降解，跨膜pH梯度随着时间降低。此外，在碱性或酸性介质中，可加速脂质体组分(主要是磷脂)的化学降解，如果灭菌过程涉及加热(如高压釜(autoclave))的话尤其如此。Stevens和Lee(Stevens和LeeAnticancerRes.2003；23：439-442)所描述的对该问题的解决方案在于制备无菌冻干脂质体，然后将其悬浮在酸性或碱性介质中，然后中和以产生跨膜pH梯度。该方法涉及冻干步骤，这通常意味着在无菌条件下制备脂质体，该过程可能昂贵且难以控制，当待冻干大体积时尤其如此。因此从工业角度来看该方法并不理想。此外，如果使用大量的脂质，如在生物解毒应用(例如腹膜透析)的情况下，冻干脂质体以可再生的方式快速重悬是有问题的。US5,393,530A描述了远程负载脂质体囊泡的方法。因此，通过将低摩尔渗透压浓度(osmolarity)(渗透浓度)的脂质体溶液与待封装物质混合来实现跨膜负载。然后，将混合物加热到高于构成脂质体囊泡之脂质的膜脂转变温度(Tc)的温度，以实现膜去稳定化并将物质并入囊泡内部。Bertrand等(ACSnano2010；4：7552-7558)描述了用于形成跨膜pH梯度脂质体的方法，其中在第一步中将酸性缓冲液封装在脂质体中。在第二步中，交换脂质体周围的外部缓冲液以在所形成的脂质体的内部和外部之间建立跨膜pH梯度。本专利技术的一个目的是提供可以以简单的方式生产稳定的跨膜pH梯度囊泡而无现有技术的前述限制的制备方法。特别地，所述制备方法的工业应用是可能的。该目的通过具有权利要求1特征的用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法实现。这样的方法包括下文解释的步骤。在第一步中，在摩尔渗透压浓度不高于200mOsm/l的水性介质中制备由至少一种基质物质制成的囊泡。在一个实施方案中，水性介质的摩尔渗透压浓度等于或小于150mOsm/l，特别地等于或小于100mOsm/l，特别地等于或小于75mOsm/l，特别地等于或小于50mOsm/l，特别地等于或小于25mOsm/l，特别地等于或小于10mOsm/l，特别地等于或小于5mOsm/l，特别地等于或小于1mOsm/l。在一个实施方案中，摩尔渗透压浓度为1mOsm/l至200mOsm/l或在由任意前述摩尔渗透压浓度所构成的范围内(例如10mOsm/l至150mOsm/l等)。在第二步中，将所述囊泡与摩尔渗透压浓度比步骤a)中水性介质的摩尔渗透压浓度高至少200mOsm/l的碱性或酸性缓冲液混合，以向所述囊泡施加渗透冲击(osmoticshock)并且获得缓冲液填充囊泡。在一个实施方案中，碱性或酸性缓冲液的摩尔渗透压浓度比步骤a)中水性介质的摩尔渗透压浓度高至少220mOsm/l，特别地高至少250mOsm/l，特别地高至少300mOsm/l，特别地高至少350mOsm/l，特别地高至少400mOsm/l，特别地高至少450mOsm/l，特别地高至少500mOsm/l，特别地高至少550mOsm/l。在一个实施方案中，碱性或酸性缓冲液的摩尔渗透压浓度比步骤a)中水性介质的摩尔渗透压浓度高200mOsm/l至550mOsm/l，或在由任意前述摩尔渗透压浓度所构成的范围内(例如220mOsm/l至500mOsm/l等)。因此，相对于第一步中使用的水性介质，所述碱性或酸性缓冲液是高渗缓冲液。这样做时，会向囊泡临时施加渗透冲击。该渗透冲击导致酸性或碱性缓冲液并入到囊泡内。因此，渗透冲击用于使囊泡短期去稳定化，以允许将缓冲液并入囊泡中。得到缓冲液填充囊泡。在一个实施方案中，高渗缓冲液还可包含电解质，其用于调节摩尔渗透压浓度或具有生理学功能。值得注意的是，向悬浮在水性介质中的囊泡添加足量的碱性或酸性缓冲液，因为否则的话将无法实现渗透冲击。取决于水性介质的摩尔渗透压浓度与酸性或碱性缓冲液的摩尔渗透压浓度之间的差异，足量可以是相当于在第一步中使用的水性介质的体积的至少0.1倍的体积，特别地至少0.3倍，特别地至少0.5倍，特别地至少0.8倍，特别地至少1.5倍，特别地至少2倍，特别地至少2.5倍，特别地至少3倍，以及特别地至少5倍。在一个实施方案中，可以以与水性介质的体积相等的体积添加碱性或酸性缓冲液。在一个实施方案中，待添加的碱性或酸性缓冲液的体积可以是水性囊泡悬浮液体积的0.1倍至5倍或由前述值构成的任意其他范围(例如0.3倍至3倍等)。在一个实施方案中，高渗缓冲液的pH值为pH1至pH6.9，特别地pH1.5至pH6.5，特别地pH2.0至pH6.0，特别地pH2.5至pH5.5，特别地pH3.0至pH5.0，特别地pH3.5至pH4.5，特别地pH3.0至pH3.5。在一个实施方案中，高渗缓冲液的pH值为pH7.1至pH14，特别地pH7.5至pH13.5，特别地pH8.0至pH13.0，特别地pH8.5至pH12.5，特别地pH9.0至pH12.0，特别地pH9.5至pH11.5，特别地pH10.0至pH11.0，特别地pH10.5至pH11.0。在一个实施方案中，高渗缓冲液可以包含额外的化学试剂，如络合剂或螯合剂。在第三步中，通过添加中和水溶液来稀释包含缓冲液填充囊泡的水性介质与碱性或酸性缓冲液的混合物。碱性或酸性缓冲液与中和溶液的混合物构成悬浮缓冲液。因此，稀释之后，得到悬浮在悬浮缓冲液中的跨膜pH梯度囊泡。因此，悬浮缓冲液的pH与缓冲液填充囊泡中包含的碱性或酸性缓冲液不同。在一个实施方案中，pH的差异为至少1pH单位，特别地至少1.5pH单位，特别地至少2pH单位，特别地至少2.5pH单位，特别地至少3pH单位，特别地至少3.5pH单位本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法，其包括以下步骤：a)在摩尔渗透压浓度不高于200mOsm/l的水性介质中制备由至少一种基质物质制成的囊泡，其中所述基质物质选自两亲性脂质和两亲性嵌段共聚物；b)将所述囊泡与摩尔渗透压浓度比步骤a)中所述水性介质的摩尔渗透压浓度高至少200mOsm/l的碱性或酸性缓冲液混合，以向所述囊泡施加渗透冲击并获得缓冲液填充囊泡；以及c)通过添加中和溶液来稀释包含所述缓冲液填充囊泡的所述水性介质与所述碱性或酸性缓冲液的混合物，以获得悬浮在悬浮缓冲液中的跨膜pH梯度囊泡，其中所述悬浮缓冲液与所述碱性或酸性缓冲液的pH值不同。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.04 EP 15166247.51.用于制备跨膜pH梯度囊泡的方法，其包括以下步骤：a)在摩尔渗透压浓度不高于200mOsm/l的水性介质中制备由至少一种基质物质制成的囊泡，其中所述基质物质选自两亲性脂质和两亲性嵌段共聚物；b)将所述囊泡与摩尔渗透压浓度比步骤a)中所述水性介质的摩尔渗透压浓度高至少200mOsm/l的碱性或酸性缓冲液混合，以向所述囊泡施加渗透冲击并获得缓冲液填充囊泡；以及c)通过添加中和溶液来稀释包含所述缓冲液填充囊泡的所述水性介质与所述碱性或酸性缓冲液的混合物，以获得悬浮在悬浮缓冲液中的跨膜pH梯度囊泡，其中所述悬浮缓冲液与所述碱性或酸性缓冲液的pH值不同。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于对步骤a)中制备的所述囊泡进行灭菌以获得无菌囊泡，然后利用这些无菌囊泡进行步骤b)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在进行步骤b)之前将所述囊泡储存第一时间段。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于在低于所述基质物质相变温度的温度下进行步骤b)。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于在不高于35℃的温度下进行步骤b)。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：让克里斯托弗·勒鲁，文森特·福斯特，瓦伦蒂娜·阿戈斯托尼，
申请(专利权)人：沃桑缇斯股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH