膜囊泡的制法制造技术

本发明专利技术涉及由生物样品制备膜囊泡的方法，其特征在于，其至少包括一个阴离子交换和／或凝胶渗透层析的样品处理步骤。本发明专利技术用以制备不同来源与类型的囊泡，特别是源于抗原呈递细胞或肿瘤细胞的囊泡。本发明专利技术亦涉及以此方式获得的囊泡及其应用。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及膜囊泡的新制法(特别是分离和/或纯化)。本专利技术亦涉及以此方法制成的膜囊泡与例如其生物学及医学应用。膜囊泡通常是由包含细胞质部分的脂双层组成的直径小于100纳米的囊泡。特别的膜囊泡更特定地经由胞内区室与细胞膜的融合获得，这使这些膜囊泡释放于生物流体或培养的细胞的上清液中。这类囊泡通常名为胞外体(exosome)。胞外体直径通常介于约50～90纳米之间，更特定地是介于60～80纳米之间，并且，有利的是，其带有与在其起源细胞的细胞膜中取向相同的膜蛋白质(特别是主要组织相容性复合体蛋白)。此外，视起源而定，胞外体包括诸如CD40、CD80与HSP70等膜蛋白而且不含内质网或高尔基体。已证实胞外体可由各种生理环境的不同细胞类型释放。在这方面，已证实，B淋巴细胞释放携带具有抗原呈递作用的第二类主要组织相容性复合体分子的胞外体(Raposo等.，J.Exp.Med.183(1996)1161)。同样地，已证实树状细胞生成胞外体，该胞外体具特定的结构特征与功能特征，并在免疫反应的介导，特别是在细胞毒性T淋巴细胞的刺激中起一定作用(亦名为树状细胞胞外体)(Zitvogel等.，Nature Medicine4(1998)594)。亦证实肿瘤细胞以受调控的方式分泌特定胞外体(亦名为肿瘤细胞胞外体)，其携带肿瘤抗原并可呈递这些抗原或将之传递至抗原呈递细胞(专利申请WO99/03499)。亦已知，肥大细胞在胞内囊泡区室中累积一些可在信号影响下分泌的分子(Smith与Weis，Immunology Today17(1996)60)。因此，作为一般规律，细胞发射信号并经由在不同生理状况下产生的膜囊泡彼此沟通，这些膜囊泡可能携带具特定结构特征与功能特性的抗原型、MHC分子或任何其他信号(细胞因子、生长因子等)。因此，这些囊泡，特别是胞外体，是一种特别希望用于诊断、疫苗接种或治疗性的应用或目的分子的传递的产品。因此，可以工业规模制备与生物性用途，特别是药理用途相容的膜囊泡的有效方法将具有特别的意义。传统的制备膜囊泡(例如胞外体)的方法涉及一系列差速离心步骤，以从培养基中存在的细胞或细胞碎片中分离囊泡。在这方面，上述文献实质地描述通过在300g、10,000g与70,000g或100,000g下的一系列离心制备囊泡，所得的团粒则溶于盐溶液以构成浓缩的胞外体溶液。此制备物可利用传统生化技术进行分析，用于评价胞外体的蛋白质组成。优选的生化技术包括在变性介质中进行电泳，加上全蛋白质的染色；或根据Western印迹技术利用抗体检测特定蛋白质。最终制备物中的胞外体可在以4％戊二醛溶液固定制备物后利用电子显微镜术直接检测。根据本方法，可得纯度令人满意的胞外体，因为该制备物可在动物模型中显示生物活性与抗肿瘤性质。然而，这些现有技术的离心方法，无法将膜囊泡(例如胞外体)与细胞蛋白质或某些大分子成份(DNA、RNA)或大分子复合体进行精细分离。因此，这些方法无法排除对人类的治疗用途不相容的未识别的生物污染物的存在。此外，这些步骤难以外延至工业规模，特别是在处理量很大时；或难以用于自体(即病人对病人)的体外应用，在其后者中该方法通常须应用于限定的系统中。本专利技术现在提供对此问题的解决方式。本专利技术说明在与工业用途和药理应用相容的条件下制备(即分离和/或纯化)膜囊泡的新方法。特别可应用本专利技术的方法取得个体化的自体胞外体制备物和由确立细胞株获得胞外体制备物，以用于实验或生物用途、或者预防或治疗性的疫苗接种目的。本专利技术更特定地基于层析分离法的使用来制备膜囊泡，特别是把膜囊泡和潜在的生物污染物分离开。更具体而言，本专利技术第一个目的是由生物样品制备膜囊泡的方法，其特征在于，其至少包括样品的阴离子交换层析处理步骤。事实上，申请人现已证明膜囊泡，特别是胞外体，可通过阴离子交换层析得以纯化。在这方面，在此应用中出人意料地证明，在阴离子交换层析后，胞外体呈一个均一峰。此结果是完全出人意料的，因为胞外体是由围绕在包括可溶蛋白的内体积周围的膜所组成的超分子复合物质。此外，胞外体包含膜蛋白。因此，本专利技术的优选目的涉及由生物样品制备膜囊泡，特别是纯化膜囊泡的方法，其中至少包括一个阴离子交换层析步骤。为应用本专利技术，可使用强或弱的阴离子交换，优选进行强的阴离子交换。此外，在一具体实施方案中，该层析是压力下进行。因而，更具体而言，其可以包括高效液相色谱法(HPLC)。在阴离子交换层析中可使用不同类型的载体。更优选的是，这些载体可以包括纤维素、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、琼脂糖、葡聚糖、丙烯酰胺、硅石、乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物、或其混合物如琼脂糖-葡聚糖混合物。为对此举例说明，可采用由上述载体组成的不同的层析装置，特别是使用下列的凝胶例如Source、Poros、Sepharose、Sephadex、Trisacryl、TSK-凝胶SW或PW、Superdex、Toyopearl HW与Sephacryl，上述凝胶皆适用于本专利技术。因此，在一具体实施方案中，本专利技术涉及由生物样品制备膜囊泡的方法，其至少包括一个步骤，在此步骤中该生物样品经阴离子交换层析处理，其中载体选自纤维素、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、硅石、丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、乙二醇-甲基丙烯酸盐共聚物，它们单独或以混合物使用，并得任选加以官能化。此外，在本专利技术范畴中，为改善该层析分离度，优选所用的载体的小珠形式。理想情形为，这些珠子具有均一且已标准化的直径，和相当高的孔隙度以使物质能在层析过程中穿透过(即胞外体)。在这方面，若设定胞外体的直径(通常介于50至100纳米)，为应用本专利技术，优选使用高孔隙度凝胶，特别是介于10纳米至5微米，更优选介于约20纳米至约2微米，最优选介于约100纳米至约1微米。对阴离子交换层析而言，所用的载体必须用能与阴离子分子作用的基团官能化。通常，此基团是由三级或四级胺组成，其分别限定弱或强的阴离子交换剂。在本专利技术范畴中，使用强阴离子交换剂是特别有利的。在这方面，根据本专利技术，使用经四级胺官能化的上述层析载体。因此，根据本专利技术一更具体的实施方案，该阴离子交换层析在以四级胺官能化的载体上进行。甚至更优选，此载体选自聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖与硅石，其单独或以混合物形式使用，并经四级胺官能化。经四级胺官能化的载体的实例包括Source Q、Mono Q、QSepharose、Poros HQ与Poros QE等凝胶、Fractogel TMAE型凝胶和Toyopearl Super Q凝胶等。有一种特别优选用于进行阴离子交换层析的载体包括聚(苯乙烯-二乙烯基苯)。可于本专利技术范畴中使用的这类凝胶的实例之一是SourceQ凝胶，特别是Source 15 Q(pharmacia)。该载体的优点是提供很大的内部孔隙，因此对流经凝胶的液体的循环只有低的阻力，同时使胞外体能快速扩散至官能团，这些官能团对指定大小的胞外体是特别重要的参数。可采用不同方式洗脱保存在柱内的生物学化合物，特别是利用渐增浓度如0～2摩尔浓度的盐溶液梯度进行。特别可使用浓度例如为0～2摩尔浓度的氯化钠溶液。以此方式纯化的不同级分则通过利用连续式分光光度读数在柱出口处测量光密度(OD)而进行检测。就做为指本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由生物样品制备膜囊泡的方法，其特征在于，至少包括一个对样品的阴离子交换层析处理。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥利维耶德林，塞巴斯莱昂阿米戈雷纳，菲利普拉莫，若埃尔克鲁泽，
申请(专利权)人：阿诺昔斯股份有限公司，法国国家卫生及研究医学协会，法国居里学院，
类型：发明
国别省市：US[美国]