制备含游离半胱氨酸残基的蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及制备含游离半胱氨酸的可溶性蛋白质的新方法，其中将宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触。然后可修饰以该方法生产的可溶性蛋白质以增强其效力。所述修饰包括附着ＰＥＧ部分以形成ＰＥＧ化蛋白质。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及制备蛋白质的方法，更具体地说涉及制备含有不形成二硫键的游离半胱氨酸的重组蛋白质的方法。
技术介绍
就病人和医护人员而言，对于开发低成本，长效，“使用方便”(“user-friendly”)的蛋白质疗法具有极大兴趣。蛋白质制备昂贵且不同于其它常规小分子药物，它通常不容易被身体吸收。而且如果经口服给药它们会被消化掉。因此，蛋白质一般必须经注射给药。注射后，大多数蛋白质被迅速从体内清除，因此必须经常，通常是每天，都要进行注射。病人不喜欢注射，这样就导致应变性下降并降低药物效力。有些蛋白质，如促红细胞生成素(EPO)，当不经常给药时也是有效的，但这是由于该蛋白质是糖基化的事实引起的。糖基化需要使用哺乳动物表达系统来生产重组蛋白质，但这较昂贵且增加了蛋白质药物的成本。因此，强烈需要开发降低病人和医护人员对蛋白质药物花费的蛋白质传递技术。解决该问题的一个方法是开发延长蛋白质治疗剂在体内的循环半衰期的方法使得不需经常注射该蛋白质。这一解决方法也可满足病人对“使用方便”的蛋白质疗法(即，不需要经常注射的蛋白质疗法)的需要和希望。已证实用聚乙二醇(PEG)对蛋白质的共价修饰是延长蛋白质在体内的循环半衰期的有用方法(Abuchowski等，1984；Hershfield，1987；Meyers等，1991)。将PEG共价附着到蛋白质上增加了蛋白质的有效大小并降低了从体内清除它的速率。可买到几种大小的PEG，通过使用不同大小的PEG可以使得PEG修饰的蛋白质的循环半衰期适应于个体适应症。其它文献证实PEG修饰的体内益处在于增强了蛋白质的可溶性，稳定性(很可能是防止蛋白质被蛋白酶消化)和降低蛋白质的免疫原性(Katre等，1987；Katre，1990)。PEG连接蛋白质的一个已知方法是使用诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG的化合物将PEG附着列游离胺上，一般是在赖氨酸残基或在N-末端氨基酸上。该方案的一个主要的局限性在于蛋白质除了N-末端氨基酸外，一般还含有几个赖氨酸，PEG部分非特异性地附着到蛋白质的任何可接近的游离胺上，产生不同种的产物混合物。许多NHS-PEG化蛋白质由于其低比活和异质性而不适用于商业用途。失活是由生物学活性所需的一个或多个赖氨酸残基或N-末端氨基酸被共价修饰或者由于PEG部分靠近蛋白质的活性位点的共价附着而引起的。与本申请特别相关的是这样的发现，即用包括NHS-PEG试剂的胺反应试剂修饰的人生长激素(hGH)使得蛋白质的生物学活性降低了超过10倍(Teh和Chapman，1988；Clark等，1996)。GH是由垂体腺分泌的一种22KD的蛋白质。GH刺激骨骼，软骨和肌肉的代谢并且是儿童时期刺激躯体生长的主要激素。重组人GH(rhGH)用于治疗由于GH不足引起的躯体矮小症，特纳综合症和儿童肾机能不全症。GH不被糖基化且当在细菌中生产时具有完全的活性。该蛋白质具有较短的体内半衰期且必须每天皮下注射给药以达到最大效力(MacGillivray等，1996)。对于开发长效形式的hGH具有极大的兴趣。用胺反应性PEG试剂经PEG连接蛋白质产生长效形式的hGH的尝试取得的成功有限，因为PEG连接时生物学活性明显下降。而且，该蛋白质变成在多个位点与PEG连接(Clark等，1996)。hGH除了N-末端氨基酸外，含有9个赖氨酸。这些赖氨酸中有些位于该蛋白质已知对受体结合关键的区域(Cunningham等，1989；Cunningham和Wells，1989)。这些赖氨酸残基的修饰明显降低了受体结合和该蛋白质的生物学活性(de la Llosa等，1985；Martal等，1985；Teh和Chapman，1988；Cunningham和Wells，1989)。hGH容易被NHS-PEG试剂修饰，但NHS-PEG蛋白质的生物学活性严重受损，用5Kda PEG部分修饰的GH蛋白质仅占野生型GH生物学活性的1％(Clark等，1996)。这种多PEG化GH蛋白质的EC50为440ng/ml或大约20nM(Clark等，1996)。除了生物学活性明显下降外，由于不同数目的PEG部分附着到蛋白质上和在不同的氨基酸残基上附着，NHS-PEG-hGH具有极大的异质性，这也影响了其作为潜在治疗剂的有用性。Clark等(1996)表明NHS-PEG-hGH在动物中的循环半衰期相对于未修饰的GH明显延长。尽管体外生物学活性明显降低，但在大鼠GH-缺陷模型中NHS-PEG-hGH是有效的且比未修饰的hGH给药频率要低(Clark等，1996)。然而，在动物模型中需要高剂量的NHS-PEG-hGH(每只大鼠每次注射60-180μg)产生效力，因为修饰的蛋白质比活较低。明显的是需要更好的方法以产生保留更高生物学活性的PEG化hGH蛋白质。还需要开发PEG连接hGH的方法，以这种方式产生同型PEG-hGH产物。其它几种商业上重要的蛋白质的生物学活性也被胺反应PEG试剂显著降低。EPO含有几个对蛋白质的生物学活性关键性的赖氨酸残基(Boissel等，1993；Matthews等，1996)且EPO中赖氨酸残基的修饰导致几乎完全丧失生物学活性(Wojchowski和Caslake，1989)。用胺反应性PEG共价修饰α-干扰素-2导致生物学活性丧失40-75％(Goodson和Katre，1990；Karasiewicz等，1995)。用大型(例如，10KDa)PEG使得生物学活性丧失最大(Karasiewicz等，1995)。用胺反应性PEG共价修饰G-CSF导致生物学活性丧失60％以上(Tanaka等，1991)。用胺反应性PEG广泛修饰IL-2导致生物学活性丧失90％以上(Goodson和Katre，1990)。用于PEG连接蛋白质的第二种已知的方法是使用半胱氨酸反应性PEG将PEG共价附着到半胱氨酸残基上。可以买到许多具有不同反应基团(例如，马来酰亚胺，乙烯砜)和不同大小PEG(2-40kDa)的高特异性半胱氨酸反应性PEG。在中性pH下，这些PEG试剂选择性地附着到“游离”半胱氨酸残基，即，不形成二硫键的半胱氨酸残基上。大多数蛋白质中的半胱氨酸残基参与形成二硫键且不可能用于使用半胱氨酸反应性PEG的PEG连接。通过使用重组DNA技术的体外诱变，可将额外的半胱氨酸残基导入蛋白质的任意位置。这种新添加的“游离”半胱氨酸可用作使用半胱氨酸反应性PEG的PEG部分特异性附着位点。该添加的半胱氨酸残基可取代蛋白质中已有的氨基酸，或添加到蛋白质的氨基末端之前或蛋白质的羧基末端之后，或插入到蛋白质的两个氨基酸之间。另外，可以删除天然二硫键中涉及的两个半胱氨酸中的一个或用另一氨基酸取代它，使得天然的半胱氨酸(该蛋白质中正常情况下与缺失或取代的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基)游离并用于化学修饰。取代该半胱氨酸的氨基酸优选是中性氨基酸，如丝氨酸或丙氨酸。生长激素有两个能被碘乙酰胺还原并烷基化而不影响其生物学活性的二硫键(Bewley等，(1969))。4个半胱氨酸中的每一个都可以是用于缺失或以另一氨基酸取代的理想靶。已知一些天然存在的蛋白质含有一个或多个“游离”的半胱氨酸残基。这种天然存在的蛋白质的例子包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
获得具有游离半胱氨酸的可溶性蛋白质的方法，包括下列步骤： （ａ）获得能表达该可溶性蛋白质的宿主细胞； （ｂ）将该宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触；和 （ｃ）从宿主细胞分离可溶性蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治N考克斯，丹尼尔H多尔蒂，玛丽S罗森达尔，
申请(专利权)人：博尔德生物技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]