三角帆蚌多糖的制备方法。将三角帆蚌肉搅碎，热水抽提；６０～１００目过滤，浓缩滤液后加入乙醇沉淀，将沉淀用热水复溶，调节ｐＨ至７～１０，按复溶物料中的蛋白重量计加入０．３～０．６％的复配蛋白酶，３０～６０℃酶解４～８ｈ；复配蛋白酶的组成为：碱性蛋白酶（Ａｌｃａｌａｓｅ）和复合蛋白酶（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）等量混合；酶解后的物料在８０～９０℃下灭酶，用乙醇二次沉淀，沉淀物真空干燥，粉碎过６０目，即得三角帆蚌多糖制品。实验证明：本发明专利技术方法制备的三角帆蚌精制多糖具有诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的能力，可以提高小鼠血清溶血素抗体积数值，能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数，有多种生物活性，具有作为药用资源及保健食品的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及医药及保健食品及应用，具体为一种三角帆蚌多糖的 制备方法及应用，特别是三角帆蚌多糖的酶法提取制备工艺。技术背景三角帆蚌(hyriopsiscumingii)俗称河蛘、珍珠蚌、三角蚌，属淡水双壳类软体动物， 辨鳃纲、珍珠科、帆蚌属，广泛分布于我国浙江、湖南、湖北、安徽、江苏、江西等省。 我国淡水珍珠的规模化人工育珠已有30多年历史，河蚌珍珠养殖取珠后，蚌肉作为下脚料， 除少量鲜食外，绝大部分经简单加工处理后，干燥粉碎作为饲料，资源浪费严重，经济利 用价值极低，若处理不及时，还会对环境造成污染。科学分析表明，三角帆蚌肉含有丰富 的蛋白质、脂肪、糖类及矿物质，其中蛋白质(干基)含量达40%左右，含有人体必需的 八种氨基酸，吸收利用率高，糖类为多糖化合物，含量为30%左右，具有抗疲劳、抗癌等 多种生物活性，多糖可用作药用资源及保健食品。曾有报告从三角帆蚌中获得粗多糖组分 具有增强小鼠免疫功能的作用，利用粗多糖提取珠蚌单体多糖ZBP- I及在制备肿瘤药中的 应用(专利号CN1544478A)，珠蚌均质多糖ZBP-1和ZBP-II及其在制备保肝保健品和保 肝药物中的应用(专利号CN1935847A)，采用5免NaOH的浓度、4"C提取三角帆蚌多糖的工 艺(中成药，2006， 28(5): 746-748)但采用酶法提取制备三角帆蚌多糖的工艺还未见报道。由于蛋白质易溶于稀碱溶液，采用碱提取粗多糖会使产品蛋白质含量增加，而采用酶 法水解除蛋白工艺，与有机溶剂除蛋白工艺相比，反应条件温和，安全且可保持多糖产品 的生物活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种较稳定的有较高得率和纯度的三角帆蚌多糖的提取制备工艺。本专利技术为一种三角帆蚌混合多糖的提取制备工艺，其提取方法以三角帆蚌肉为原料， 热水提取，乙醇沉淀，采用生物酶解工艺去除蛋白，再用乙醇二次沉淀，经真空干燥制成 成品。本专利技术工艺采用生物技术的方法去除蛋白，制成的三角帆蚌多糖精制品，多糖含量 高，溶解度好，脂肪含量低，食用安全，具有增强免疫力功能。本专利技术的工艺流程为三角帆蚌肉搅碎；热水抽提；过滤浓縮；醇沉；沉淀加水复溶；生物酶解除蛋白；浓 縮醇沉；真空干燥；成品。本专利技术的方法分述为以下步骤(1) 将三角帆蚌肉用机械搅碎后热水抽提，热水抽提的原料与水的体积比为1 : 4~6， 煮开后温度控制在90 100。C，抽提时间为10 20min;(2) 将抽提所得物料采用60 100目细布过滤，收集滤液，浓縮滤液至原滤液体积的 12.5 20%，再加入90~95%的乙醇进行沉淀，加入量以测定酒精度为60°~85° 为止，放置8 10h，离心取沉淀；(3) 在沉淀中加入70 10(TC热水复溶，调节pH至7 10，按复溶物料中的蛋白重量计 加入0.3~0.6%的复配蛋白酶，在30 60'C的水浴中酶解4 8h，复配蛋白酶的组成为 碱性蛋白酶(Alcalase)和复合蛋白酶(Protamex)等量混合；(4) 酶解后的物料在80 90。C下灭酶15 20min，冷却，加90~95%的乙醇进行二次沉 淀，加入量以测定酒精度为60°~85°为止，放置8 10h，离心，沉淀置40 50。C 真空干燥，粉碎过60目，即得三角帆蚌多糖制品。本专利技术制备三角帆蚌精制多糖的工艺稳定，提取率高，可用作工业化生产，采用斐林 试剂法测定三角帆蚌精制多糖总糖含量》85.0% (以无水葡萄糖计)，凯氏定氮测定蛋白质 含量《4%。三角帆蚌多糖可作为保健食品，动物试验表明具有增强免疫力功能。 具体实施例方式实施例l三角帆蚌多糖的提取制备工艺三角帆蚌肉采用机械搅碎，热水抽提按原料水为i : 4~6煮开，温度控制在90~ioo'C，时间为10 20min;过滤采用60~80目细布过滤，浓縮至滤液体积的五至八分之一，再 加入90~95%的乙醇进行沉淀，测定酒精度为60°~70°，放置10h， 3500rpm离心，上清液回 收乙醇，沉淀再加80 100。C热水复溶，调节pH至7~10左右，加入0.3~0.6%的复配蛋白 酶(以蛋白含量计)，复配蛋白酶的组成为碱性蛋白酶(Alcalase)、复合蛋白酶(Protamex)， 二种酶等量混合在30 6(TC的水浴中酶解4 8h。酶解后，在80 90'C下灭酶15 20min，冷 却，，加入90~95%的乙醇进行二次沉淀，测定酒精度为60°~85°，放置8~10h， 3500卬m离 心，上清液回收乙醇，沉淀置40 50。C，真空干燥，粉碎过60目，即得三角帆蚌多糖精制 品。得率为7%。采用斐林试剂法测定三角帆蚌精制多糖总糖含量为90.0% (以无水葡萄糖 计)，凯氏定氮测定蛋白质含量为3.5%。若只采用热水抽提醇沉方法制备，多糖制品中蛋白 质含量为10%，总糖含量为80. 0%。实施例2三角帆蚌精制多糖增强增强免疫力的功能试验 (一)三角帆蚌精制多糖对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响 1实验材料实验用ICR小鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物许可证号为SCXK (沪)2007—0005，清洁级，雌性，体重20士2g。饲料由浙江省实验动物中心提供，执行 标准GB14924—2001。检测环境条件，温度20-23°C，相对湿度50-70%。动物于试验前在动 物房环境中适应3天。 2剂量设计实验设3个剂量组和蒸馏水对照组。三剂量分别称取三角帆蚌精制多糖样品0.6、 1.2 和3. 6 g加蒸馏水至60ml，配置成0. 01g/ ml、 0. 02 g/ ml和0. 06 g/ ml三个浓度，灌胃 给样品，灌胃容量按O.l ml / 10g体重计。 3实验方法和结果各组灌胃给样品，每天一次，连续30天。在试验第30天，每鼠无菌取脾，置于盛有 适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、 计数，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为3X10e个/ml。将细胞悬液分两孔加入 24孔培养板中，每孔lml， 一孔加75ulConA液(相当于7.5ug/ml)，另一孔作为对照，置 37°C、 5%0)2培养箱中72小时。培养结束前4小时，每孔轻轻吸去上清液0. 7ml，加入0. 7ml 不含小牛血清的PRMI1640培养液，同时打入MTT (5 mg/ml) 50ul/孔，继续培养4小时。 培养结束后，每孔加入lml酸性异丙酮，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。在570nm波长 处测定光密度值(0D)。最后用ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细 胞的增殖能力。结果见表l。与阴性对照组(蒸馏水)比较，中、高剂量组能提高ConA诱导的小鼠脾 淋巴细胞的增殖能力，差异均有显著性。表l<table>table see original document page 5</column></row><table>(二)三角帆蚌精制多糖对绵羊红细胞诱导小鼠DTH的影响各组灌胃给样品，每天一次，连续30天。在试验第25天，每只鼠腹腔注射0.2ml 2% (v/v)压积绵羊红细胞(SRBC)悬液，进行免疫。免疫后4天，测量左本文档来自技高网...
【技术保护点】
三角帆蚌多糖的制备方法，其特征在于以下步骤： （１）将三角帆蚌肉用机械搅碎后热水抽提，热水抽提的原料与水的体积比为１∶４～６，煮开后温度控制在９０～１００℃，抽提时间为１０～２０ｍｉｎ； （２）将抽提所得物料采用６０～１００目细布过滤，收集滤液，浓缩滤液至原滤液体积的１２．５～２０％，再加入９０～９５％的乙醇进行沉淀，加入量以测定酒精度为６０°～８５°为止，放置８～１０ｈ，离心取沉淀； （３）沉淀中加入７０～１００℃热水复溶，调节ｐＨ至７～１０，按复溶物料中的蛋白重量计加入０．３～０．６％的复配蛋白酶，在３０～６０℃的水浴中酶解４～８ｈ，复配蛋白酶的组成为：碱性蛋白酶（Ａｌｃａｌａｓｅ）和复合蛋白酶（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）等量混合； （４）酶解后的物料在８０～９０℃下灭酶１５～２０ｍｉｎ，冷却，加９０％～９５％的乙醇进行二次沉淀，加入量以测定酒精度为６０°～８５°为止，放置８～１０ｈ，离心，沉淀置４０～５０℃真空干燥，粉碎过６０目，即得三角帆蚌多糖制品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张燕平，戴志远，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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