橡胶聚合酶的生产方法技术

本文发现了基本上纯的橡胶聚合酶和其类似物．基本上纯的橡胶聚合酶可以从化学稳定的三叶胶巴西勒因胶乳中进行分离和提纯．类似物是三叶胶巴西勒因的大的同系物，在酶学方面具有同样功能．本发明专利技术提出了橡胶聚合酶的分离和提纯的种种方法．同时还提出了用基本上纯的橡胶聚合酶生产天然橡胶或有关共聚物的用途．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到基本上纯的各种橡胶聚合酶、它们的生产方法以及在天然橡胶(特别是高分子量的天然橡胶)的体外合成方面的用途。 天然橡胶存在于上千种植物中。曾报道过几种真菌也可用来合成天然橡胶。大部份植物以及所有的真菌都含有少量的橡胶，但其分子量太低，做为橡胶而言无商业价值。 商业上天然橡胶的二个来源是三叶胶巴西勒因和银胶菊。三叶胶巴西勒因是天然橡胶的主要来源，银胶菊是本世纪前半期天然橡胶的商业来源，1910年占世界供应量的10%。二次大战时，美国在东南亚的天然橡胶来源被切断，银胶菊做为紧急橡胶生产计划的一部分，由美国林业部进行过大规模的种植。战后，三叶胶巴西勒因的高使用性能和廉价，使银胶菊不再成为具有吸引力的天然橡胶的来源，三叶胶巴西勒因的优势一直延续到今天。最近各种经济和政治的倾向使高分子量的天然橡胶向另一些来源发展。这另一些来源之一是体外合成。 三叶胶巴西勒因的生物合成路线已建立并进行过详述，阿尔齐尔(Archer)和奥德利(Andley)曾发表在酶学进展(Advance in Enzymology)(第29期，221-257页，1967年)学报上;而李南(Lynen)曾发表在马来西亚橡胶研究所会刊上(J.Rnhher Res Inst Molaya，21(4)，389-406 1969)。橡胶生物合成的最后一步是借助于橡胶聚合酶的催化反应，而橡胶聚合酶可存在于胶乳中。酶的催化反应是用无机焦磷酸盐的生产方法，使焦酸异戊烯酯(IPP)在焦磷酸烯丙酯上进行聚合反应而制取橡胶。这种酶也称为橡胶转移酶或焦磷酸顺式-1，4-聚异戊二烯焦磷酸异戊烯酯，顺式-1，4-聚异戊二烯转移酶。它是被称为异戊烯转移酶的酶家族中的一个成员。它可使焦磷酸异戊烯酯聚合成不同的链长和不同的立体化学构象。“橡胶聚合酶”这一术语，在本文中用来描述酶。 在三叶胶巴西勒因胶乳中，酶主要是与橡胶粒子结合在一起，但也可在溶液中发见(Archer和Andley)，橡胶的合成发生在橡胶粒子的表面(Lynen)。虽然橡胶聚合酶的研究曾在很多试验室中进行(Archer和Audley，Lynen，以及Archer和Cock-bain)后者的文章发表在酶学方法中(见Methods in Enzy-nology，15，476-481，1969)，但从三叶胶巴西勒因或其他来源的基本上纯的橡胶聚合酶的合成，在本文之前尚未成功。 基本上纯形式的橡胶聚合酶，对橡胶工业而言，将具有很重要的多方面的用途。酶在溶液中即能固定不动，也能自由游离，可用于体内天然橡胶的生产。不用三叶胶巴西勒因也可以生产橡胶，但要在工厂附近的许多地方将橡胶加工成最后部件，例如加工成轮胎。另外，用体外法生产的天然橡胶，甚至超过了从三叶胶巴西勒因胶乳生产的橡胶，因为用体外法生产天然橡胶的各种条件能够控制，这样得到的橡胶纯度高，或者具有其他人们所希望的化学或物理性能。例如，体外法橡胶，质量均匀，基本上没有各种蛋白质和类脂物，它们会影响天然橡胶的某些用途。 其它的重要用途是用来制备基本上纯的橡胶聚合酶的各种抗体。这类抗体可用来发展植物的和其他生物的筛选方法，去测定在这类生物体内的橡胶聚合酶的数量。 在其他的更重要的用途中，纯酶可以连续使用，使用连续的酶可以合成橡胶聚合酶基因或者用于基因的探测。曾经用于酶的基因的测定，并能将其生产天然橡胶的能力引入到其他生物体中。后来知道了更多的关于酶的组成和结构，可用位置定向诱变法去生产具有各种催化性能的橡胶聚合酶。这样就更能够将天然橡胶通过体内和体外法的生物合成加以控制。 本专利技术的目的是提供各种基本上纯形式的橡胶聚合酶，和具有相等或较高性能的这类聚合酶的活性类似物。 本专利技术的另一目的是提供各种橡胶聚合酶的分离及提纯方法。 本专利技术的其他目的是提供用基本纯形式的橡胶聚合酶去生产天然橡胶，特别是高分子量的天然橡胶或者生产共聚物。 本专利技术的更进一步的目的是提供用来生产天然橡胶(特别是高分子量天然橡胶)方法中的一种配料的制备方法。 为达到上述各目的，需要寻找基本上纯形式的橡胶聚合酶。在一个较好的实例中，基本上纯形式的橡胶聚合酶是从三叶胶巴西勒因胶乳中找到的。在另外的实例中，各种活性类似物基本上是各种纯的多肽，具有橡胶聚合酶的活性，这类多肽至少有一个活性位置，其位置同从三叶胶巴西勒因胶乳中发现的橡胶聚合酶基本上对等，或者在酶的作用方面可与从三叶胶巴西勒因胶乳中找到的这类聚合酶具有同等功能。在其他的实例中，活性位置可以改变，可形成具有较高橡胶聚合酶活性的多肽。在本专利技术中的一个特别好的实例中，橡胶聚合酶可以是单体，分子量大约从36，000至44，000，是用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的。 根据本专利技术可提供一种基本纯形式的橡胶聚合酶的生产方法，橡胶聚合酶是从含有三叶胶属的一种植物的化学稳定胶乳中提取出来的，三叶胶中含有橡胶聚合酶，它可与胶乳中的橡胶粒子结合在一起，也可游离在溶液中，还提供一种橡胶聚合酶的分离方法，这一方法是将游离的橡胶聚合酶从胶乳中分离出来。提供一种橡胶聚合酶的提纯方法，可将游离的橡胶聚合酶进行提纯。化学稳定胶乳是将一种含有多羟基化合物，一种抗微生物试剂，缓冲试剂的稳定组合物加入到胶乳中而制备的。在一个较好的实例中，稳定组合物还含有巯基化合物。 溶液中的游离的橡胶聚合酶可以用色谱法从胶乳中分离出来，最好选用离子交换色谱分离法。 在较好的实例中，橡胶聚合酶是用渗析法将分离后的橡胶聚合酶制成渗析液而提纯的。将凝胶加到渗析液中，使之生成凝胶-聚合物酶络合物，将此络合物分离，从络合物中提取聚合酶，然后将提取后的聚合酶再通过凝胶过滤色谱，就可生产出基本上纯的橡胶聚合酶。 在另外的较好的实例中，聚合酶的分离与提纯是使化学稳定胶乳与橡胶聚合酶的固定抗体接触，使生成橡胶聚合酶抗体络合物，分离此络合物，并从络合物中回收橡胶聚合酶。在另一实例中，橡胶聚合酶的提纯是将溶液中的游离的橡胶聚合酶与橡胶聚合酶的固定抗体接触，使生成橡胶聚合酶-抗体络合物，分离此络合物，然后从络合物中回收橡胶聚合酶。 本专利技术还提供用生成含有焦磷酸异戊二烯酯，焦磷酸烯丙酯和基本上纯的橡胶聚合酶的反应混合物而生产天然橡胶的方法;将反应混合物培育足够的时间，用于生产天然橡胶;再将天然橡胶回收。在一个较好的实例中，可生产高分子量的天然橡胶。 在另一个实例中，提供了一个生产共聚物的方法，该方法是用生成一种含有焦磷酸异戊烯和至少含有一种其他的可共聚的单体，焦磷酸烯丙酯，和基本上纯的橡胶聚合酶的反应混合物;将反应混合物培育足够时间使生成共聚物;然后再回收共聚物。 本专利技术还涉及到一种制备焦磷酸双二甲基烯丙酯的方法该方法是使之生成含有焦磷酸异戊烯，焦磷酸异戊烯异构酶，二价金属离子，磷酸酶阻化剂和缓冲试剂的反应混合物;再将反应混合物培育足够时间，使生成焦磷酸二甲基烯丙酯;然后再回收焦磷酸二甲基烯丙酯。 本专利技术的其他各项目的和优点将放在本专利技术的说明中进行阐述和实施。这些目的和优点是可以用各种手段和联合装置，特别是用在附加说明中提出的各种手段和联合装置而能实现和得到。 现在将用本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术特征发现了一种基本上纯形式的橡胶聚合酶。

【技术特征摘要】
US 1985-4-8 720,7401、本发明特征发现了一种基本上纯形式的橡胶聚合酶。2、根据权利要求1所述的橡胶聚合酶，其特征在于其中所述的聚合酶是从三叶胶属的植物中发现的。3、根据权利要求1所述的橡胶聚合酶，其特征在于其中所述的聚合酶是从三叶胶巴西勒因胶乳中发现的。4、根据权利要求1所述的橡胶聚合酶，其特征在于其中所述的聚合酶是一种单体，分子量大约从36，000至44，000，是用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的。5、含有基本上纯的多肽的橡胶聚合酶，至少具有一个活性位置。6、根据权利要求5所述的橡胶聚合酶，其特征在于其中所述的多肽，是从三叶胶巴西勒因胶乳中发现的，橡胶聚合酶基本上是同系物。7、根据权利要求5所述的橡胶聚合酶，其特征在于其中所述的多肽，至少有一个活性点，其发酵功能相当于从三叶胶巴西勒因胶乳中找到的橡胶聚合酶的活性。8、根据权利要求5所述的橡胶聚合酶，其特征在于其中所述至少一个活性点，是从三叶胶巴西勒因胶乳中的橡胶聚合酶的相应位置改变而生成具有增强橡胶聚合酶活性的多肽。9、一种生产基本上纯形式的橡胶聚合酶的方法，包括下述各步骤先从含有橡胶聚合酶的三叶胶属的一种植物中制备化学稳定的胶乳，这种酶可与上述胶乳中的橡胶粒子结合在一起，也可以游离于溶液中;将上述胶乳溶液中的游离的橡胶聚合酶进行分离;再将分离后的橡胶聚合酶提纯，可以得到基本上纯的形式。10、根据权利要求9，其特征在于其中所述的植物是三叶胶巴西勒因。11、根据权利要求9，其特征在于其中所述制备稳定胶乳是指将大约1至10体积的，由多羟基化合物、防微生物试剂和缓冲剂组成的稳定溶液，加入到大约一个体积的上述胶乳中。12、根据权利要求11，其特征在于其中所述稳定溶液可以含有巯基化合物。13、根据权利要求11，其特征在于其中所述多羟基化合物可以是甘油，山梨糖醇、蔗糖等。14、根据权利要求11，其特征在于其中所述稳定溶液是由大约10%至80%(重量/体积)的甘油，大约0.001%至1%(重量/体积)的叠氮化钠，和缓冲剂组成的;溶液的PH值大约从7至12。15、根据权利要求14，其特征在于其中所述稳定溶液是由50%(重量/体积)的甘油，大约0.3%(重量/体积)的叠氮化钠和大约0.1M的碳酸氢钠组成的。16、根据权利要求15，其特征在于其中所述稳定溶液，还含有大约5mm的半胱氨酸。17、根据权利要求9，其特征在于其中所述分离是指色谱分离法。18、根据权利要求17，其特征在于其中所述色谱分离法是指离子交换色谱法。19、根据权利要求18，其特征在于其中所述离子交换色谱法是指包括用离子交换树脂与上述胶乳混合的色谱分离方法，上述在溶液中游离的橡胶聚合酶与树脂结合，生产聚合酶-树脂络合物，分离络合物，然后从络合物中把橡胶聚合酶取出。20、根据权利要求19，其特征在于其中所述离子交换树脂是指阴离子交换树脂。21、根据权利要求9，其特征在于其中所述分离是在4℃时进行的。22、根据权利要求9，其特征在于其中所述提纯，包括下述各步骤渗析将上述要分离的橡胶聚合酶制成一种渗析液;加一种凝胶剂到上述渗析液中，使生成凝胶聚合酶络合物;分离将上述络合物从上述渗析液中分离出来;取出将上述聚合酶从上述络合物中取出;将取出的聚合酶进行凝胶过滤色谱分离，可得到基本上纯形式的橡胶聚合酶。23、根据权利要求22，其特征在于包括另一操作步骤将上述渗析液与一种吸附蛋白质的吸附剂混合，然后再将预先将上述凝胶加到上述渗析液中的上述吸附剂取出。24、根据权利要求23，其特征在于其中所述吸附剂是指γ-氧化铝。25、根据权利要求22，其特征在于其中所述凝胶是指磷酸钙凝胶。26、根据权利要求9，其特征在于其中所述提纯，包括下述各步骤将上述溶液中游离的橡胶聚合酶与可同橡胶聚合酶结成抗体络合物的各种固定抗体接触，以便生成橡胶聚合酶抗体络合物;从上述溶液中将络合物分离;从上述络合物中将橡胶聚合酶取出。...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫吕汉超，戴维斯科特施里夫，
申请(专利权)人：固特异轮胎和橡胶公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]