一种共价活化的固定化酶载体制造技术

本发明专利技术属于生物化学领域，是一种经共价活化的可制备固定化酶的蛋白质载体．本发明专利技术所说的固定化酶载体是一种经共价活化的蚕丝蛋白，它来源丰富、加工方便、机械强度和通透性好，可制成丝状、线状、纤维织物状，所得的固定化酶的比活性和稳定性高，是实现工业规模的酶反应过程的理想载体．（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学领域，是一种经共价活化的可制备固定化酶的蛋白质载体。已知的共价活化法制备固定化酶的载体，多用合成载体，例如多糖类衍生物，氨基酸聚合物，聚丙烯酰胺，苯乙烯树脂，多孔玻璃芳香胺衍生物等各种聚合物。由于共价化学键较稳定，因此共价法制备的固定化酶，酶和载体之间的结合极其牢固，但上述一类载体的共价活化，控制条件苛刻，反应激烈，操作复杂。对于某些不能予先活化的载体，如果载体通过双功能用试剂与酶共价偶联的话，常引起酶蛋白的高级结构发生变化，并导致活性中心的破坏，使酶活力下降。蛋白质载体提供了酶的天然环境，可予先接枝共价活化，使得固定化条件较温和，有利于酶活性的保存和稳定性的提高。已有人使用胶原蛋白作固定化酶的载体，但胶原蛋白的制备技术较复杂，是用牛皮、牛肋等组织经处理而得，铺膜的厚度难以均匀，特别是其机械强度和通透性较差，难于实现工业规模的酶反应过程。此外，用胶原蛋白作载体，所得的固定化酶的比活性较低。本专利技术的目的是要寻找一种来源丰富，价格低廉，加工方便，机械强度与通透性好，能予先共价活化，适宜于酶生存的载体，用它制得的固定化酶不仅具有高的比活性，而且便于实现工业规模的酶反应过程。本专利技术所指的固定化酶的载体是一种经“共价活化的蚕丝蛋白”，其制备方法有二种1.蚕丝蛋白表面羟基的活化(重叠法)先使蚕丝蛋白在碱性条件下与对β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应，使成为具有芳香族氨基的非水溶性载体(对氨基苯磺酰乙基-蚕丝蛋白)，然后用盐酸和亚硝酸钠处理，生成重氮盐化合物，即得到本专利技术所说的经“共价活化的固定化酶载体”(共价活化的蚕丝蛋白)，再与酶发生重氮偶合反应，制得固定化酶。2.蚕丝蛋白表面羧基的活化(酰代叠氮法)在室温下，将蚕丝蛋白在甲醇-盐酸混合液中浸泡数十小时，取出，用水漂洗后，在肼溶液中浸几小时，得到蚕丝蛋白的酰肼衍生物，再用亚硝酸钠-盐酸溶液处理，便成为蚕丝蛋白-酰代叠氮衍生物，即得本专利技术所说的经“共价活化的固定化酶载体”(共价活化的蚕丝蛋白)，再与酶发生重氮偶合反应，制得固定化酶。本专利技术的载体-共价活化的蚕丝蛋白有一个最佳活化条件即将蚕丝蛋白浸入SESA-2%Na2CO3水溶液中，先在80℃左右保温10分钟，加入适量无水Na2CO3，在80℃下继续保温45分钟，取出，用冰水充分漂洗，然后在0℃下用Na2NO2-HCl溶液处理3分钟，取出后，再用冰水充分洗涤，即得本专利技术所说的固定化酶载体-共价活化的蚕丝蛋白载体。经共价活化的蚕丝蛋白，较胶原蛋白有如下显著优点(1)蚕丝蛋白的成份一般由18～20种氨基酸构成，表面带有比胶原蛋白更多的-OH基团和-COOH基团，因此用它制得的固定化酶的活性和稳定性均比胶原蛋白作载体制得的固定化酶的活性和稳定性要高。例如用2.5Cm×1.5Cm蚕丝蛋白片料，经共价活化制得的固定化酶(如固定葡萄糖氧化酶)，在20ml 1%葡萄糖溶液(作底物)中，pH5.5，温度30℃下反应半小时，测得其比活性为59nmoles/min·Cm2;同样条件下，用胶原蛋白固定葡萄糖氧化酶时，测得的比活性仅为17.8nmoles/min·Cm2。(2)蚕丝蛋白来源丰富，一般市售的丝织物均可作为原料，加工成“共价活化的蚕丝蛋白”-固定化酶的载体，制备上比胶原蛋白要方便的多。(3)蚕丝蛋白的机械强度和通透性要胶原蛋白好得多，蚕丝蛋白可以制成丝状，线状，纤维织物状等，大大提高了固定化的表面积，这些都有利于工业规模的酶反应过程的进行，而胶原蛋白通常只能铺成膜状，其机械强度和通透性均较差。由上可见，作为固定化酶的载体来说，本专利技术所述的共价活化的蚕丝蛋白无疑是一种有着广泛发展前景的载体。实施例1载体原料采用2.5×1.5Cm市售的绉丝片料(一种蚕丝蛋白织物，以下简称片料)酶用葡萄糖氧化酶，(以下简称酶)〔1〕固定化酶载体的制备-共价活化的蚕丝蛋白最佳活化条件称取0.1gSESA溶解于6ml 2%Na2CO3的水溶液中，过滤去除不溶物，将片料浸入上述SESA溶液中，80℃左右保温10分钟，再加入0.2g无水Na2CO3，继续在80℃下保温45分钟，取出，用冰水充分漂洗，然后在0℃下用Na2NO2-HCl溶液处理3分钟，取出后再用冰水充分洗涤即得本专利技术所说的固定化酶载体-共价活化的蚕丝蛋白载体。〔2〕固定化酶的制备将上述所得的共价活化的蚕丝蛋白浸入浓度为2mg/ml，温度为0℃的酶溶液中2小时左右，取出后用0℃冰水充分洗涤，以除去被吸附的酶，得到一种有酶活性的蚕丝蛋白-固定化酶，贮存在4℃，pH5.5的醋酸缓冲溶液中。〔3〕固定化酶比活性的测定(1)测定方法基于葡萄糖氧化酶(GOD)能催化如下反应采用辣根过氧化物酶(POD)使反应产物H2O2还原，同时使还原型邻-二茴香胺成为红色的氧化型邻一二茴香胺，测定436nm下氧化型邻一二茴香胺的光密度(O·D)，求得GOD的活性。(2)测定条件和结果将上述的固定化酶放入底物-20ml 1%葡萄糖溶液中，在30℃，pH5.5下反应半小时，测得O.D＝0.250，求得比活性为59nmoles/min·Cm2。实施例2载体原料采用干丝，其余条件均同实施例1，测得OD＝0.470，求得固定化酶的比活性为8330nmoles/min·g(干丝)。总之，本专利技术所说的载体确实是酶的固定化的理想载体。它不仅可以固定葡萄糖氧化酶，而且可以固定磷酸单酯酶、糖化酶、木瓜蛋白酶等，得到各种高比活性的固定化酶，且其稳定性好，即酶与载体的结合力强，不易从载体上脱落下来。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用重氮法或酰化叠氮法活化的天然蛋白质载体，具有酶生存的良好微环境，本专利技术的特征在于以共价活化的蚕丝蛋白作为制备高比活性的固定化酶的载体。

【技术特征摘要】
1.一种用重氮法或酰化叠氮法活化的天然蛋白质载体，具有酶生存的良好微环境，本发明的特征在于以共价活化的蚕丝蛋白作为制备高比活性的固定化酶的载体。2.按照权项要求1所说的载体，其特征在于共价活化的蚕丝蛋白有一最佳的活化条件(1)称取0.1gSESA溶解于6ml2%Na2CO3水溶液中;(2)将2.5Cm×1.5Cm蚕丝蛋白织物浸入上述SESA溶液中，在80℃左右保温10分钟，再加入0.2g无水Na2CO3，继续在...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼一心，周文瑜，
申请(专利权)人：华东化工学院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]