一种编码昆虫选择性神经毒素的合成基因，该基因含有经过优化从而有利于基因表达的编码核苷酸序列，这种优化是基于杆状病毒的密码子偏倚性或是杆状病毒复制所在的细胞中的密码子的偏倚性。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
化学杀虫剂是现代农业的必要部分，并且已经是一种通过控制虫害而减少作物损失的有效方法。然而，由于其对环境污染的潜在作用，对农学上的害虫的抗性群体的筛选，以及对非靶生物的毒性，所以化学试剂正受到不断的审查。结果是，正在寻找一种替代策略，该策略应是有效的，甚至对非靶群体及环境是有益的。其中的一种策略包括使用微生物，该微生物是自然存在的针对昆虫群体的病原体。然而，许多有希望的昆虫控制剂作为候选昆虫病原体都缺少一些经典的化学杀虫剂的特征，而这些特征是农场主或其它从事农业的人已习惯的。例如，杆状病毒科家族的昆虫特异性病毒有许多优点，包括宿主-特异性及惰性环境的特点，但却缺乏在重大的作物损失发生前迅速控制靶群体的能力。幸运的是，现代分子生物学提供了改造这些特性的必要工具，以便能满足现代农业的需要。杆状病毒对于无脊椎动物是病毒性病原体，其特征是有一双链、环状DNA基因组，大小约80到200千碱基。杆状病毒分为3个亚族，包括无包含体杆状核型病毒(NOVs)，颗粒体病毒(GVs)和核多角体病毒(NPVs)。NOVs的例子是椰二疣独角仙病毒和Helicoverpu zeaNOVs，GVs的例子包括小菜蛾颗粒体病毒，苹果蠹蛾颗粒体病毒，甘蓝粉蝶颗粒体病毒，和粉纹夜蛾颗粒体病毒。NPVs的例子包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，甜菜夜蛾核型多角体病毒，棉铃虫核型多角体病毒，Helicoverou zea NPV，单地夜蛾核型多角体病毒，粉纹夜蛾核型多角体病毒，甘蓝夜蛾核型多角体病毒，舞毒蛾核型多角体病毒，斜纹夜蛾核型多角体病毒，银纹夜蛾核型多角体病毒，枞色卷蛾核型多角体病毒，梨豆夜蛾核型多角体病毒，和绿棉铃虫核型多角体病毒。尽管曾认真研究了一些特定的颗粒体病毒和无包含体杆状核型病毒，核多角体病毒是杆状病毒各亚族中定性最为彻底的。NPV的感染周期包括二种病毒粒子。感染昆虫细胞后，出芽病毒粒子(BVs或胞外病毒，ECV)在核衣壳向质膜运动中被制造。这些病毒粒子将核来源的衣壳排入胞质中并通过出芽通过细胞质膜进入宿主昆虫的血腔中。这一过程导致了宿主昆虫的系统感染。在感染阶段的后期，病毒粒子在含有大量多角体蛋白的蛋白基质中被包被，(包含体病毒粒子)，这样形成多角包含体(PIB或包含体，OBs)。这些包含体是病毒的口腔感染形式，并且能在昆虫宿主间水平转移(1，2)。未被感染的幼虫用含病毒的食物喂食并且吞下PIBs。蛋白样基质被昆虫中肠中的酸性pH的活动所溶解这一现象发现于许多鳞翅目幼虫中。释放了的病毒粒子核衣壳，含有病毒基因组DNA，接触并感染幼虫中肠的表皮组织。典型地，被感染昆虫将继续发育并在病毒在宿主内指数扩增中继续消耗植物物质。渐渐地，经常是几周或更长一段时间后，感染的幼虫将完全受害并死亡。杆状病毒的一个吸引人的特性是其狭窄的宿主特异性。这类病毒仅感染节肢动物，并且即使在一个特别的昆虫目内也具有相对狭窄的宿主范围。宿主特异性曾用电镜，DNA杂交及重组DNA技术检验(3～5)。这些研究表明狭窄的宿主范围至少部分上是由于杆状病毒不能将病毒DNA转入哺乳动物细胞核中。NPV被用作真核生物表达载体来合成理想的异源蛋白(6，7)，这部分是由于易于得到有效的细胞培养系统及克隆载体。特别是叫苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的一种病毒，是一种已被接受的模型病毒，可用于在杆状病毒表达系统中导入并表达异源基因。该病毒常规上被作为在真核表达系统中生产大量重组蛋白的一种重要的体外方法，并能提供对表达蛋白进行合适的翻译后修饰，AcNPV能够感染鳞翅目昆虫的许多家族，而这些昆虫是重要的经济学害虫。尽管基于杆状病毒的害虫控制剂有潜在的实用的优点，然后许多缺点却限制了它们在现代农业上的应用。在中耕农业中更广泛运用该类病毒的最大障碍是其在时间上的滞后，即在使用病毒和有效地控制由宿主昆虫引起的作物损失间的时间上的滞后，不象使用经典的化学杀虫剂后可快速地观察到生效，有效的野生型杆状病毒所介导的昆虫控制仅当体内病毒群体达一危及宿主活动的高水平后才发生。然而，通过运用重组DNA技术，可通过导入控制杀虫蛋白表达的基因或通过从病毒基因组中删除一些基因，使得NPV从遗传学上被改造，从而提高其昆虫杀灭速率(8～10)。已经改造成表达昆虫选择性神经毒素的最有效的重组NPVs(11～18)。这些重组病毒杀死宿主用的时间比野生型NPVs至少少20～30％。现在，已有已构建好的重组NPVs，其致力要远远大于以前构建的NPVs。这些重组NPVs被加工以表达一编码蝎子(Leiurusquinquestriatus hebraeus)的昆虫选择性毒素蝎毒素LqhIT2的异源基因(19，20)。基于目前的研究，带有这种合成基因的重组NPVs可使病毒的杀虫的特性有很大的提高。专利技术概述本专利技术涉及重组杆状病毒，杆状病毒经过加工可以很好地表达编码昆虫-选择性神经毒素的基因。更具体地说，本专利技术涉及一分离自蝎子Leiurus quinquestriatus hebraeus的编码蝎毒素LqhIT2的核酸序列，这里所说的序列经优化后适合于在核多角体病毒感染的细胞中表达基因。本专利技术还涉及包括一密码子经优化的LqhIT2核酸序列的嵌合基因，以及包括表达一密码子经优化，昆虫选择性神经毒素比如LqhIT2毒素基因的杆状病毒的杀虫组合物，本专利技术也涉及在农学的和非农学的环境下控制昆虫的方法，其中也包括使用含有密码子经优化的，编码昆虫选择性神经毒素如LqhIT2毒素的核酸序列的昆虫杆状病毒。本例专利技术中的昆虫杆状病毒选自核多角体病毒，单或多包含体核多角体病毒，和颗粒体病毒组。优选杆状病毒选自多核衣壳核多角体病毒。特别优选的是苜蓿银纹夜蛾多衣壳核型多角体病毒(AcNPV)。本专利技术包括一编码LqhIT2蛋白的合成基因，其中该基因密码子选择上是偏向于选择核多角体病毒以及支持病毒复制的细胞所优选的密码子，这一点通过观察-已经表征的核多角体病毒蛋白，多角蛋白的编码基因以及几个鳞翅昆虫蛋白的编码基因的密码子利用而得到确定。带有合成的LqhIT2基因的重组杆状病毒感染细胞后，在细胞中所得的遗传构建物可有效地表达LqhIT2。对烟芽夜蛾使用这些重组病毒后导致幼虫的快速麻痹。更有甚者，带有偏倚性密码子的基因的病毒杀死其昆虫宿主的速度远快于那些带有LqhIT2基因互补DNA(cDNA)拷贝的病毒。附图简述，生物保藏及序列表附图说明图1.蝎子Leiurus quinquestriatus hebraeus的LqhIT2基因的cDNA序列(LqhIT cDNA)以及编码LqhIT2的密码子-偏倚性的合成的结构基因(LqhITNPV)的序列图。黑体字符表示cDNA序列中的无义核苷酸变化，这些变化的引入是为了促进基因表达。图2.用来构建LqhIT2基因的密码子-偏倚性形式的合成寡核苷酸的序列。寡核苷酸Lq1编码家蚕素的信号肽。寡核苷酸Lq1和Lq10用作合成基因的PCR扩增中的引物。图3.制备LqhIT2基因的密码子偏倚性形式的策略的流程图。寡核苷酸Lq1和Lq10(以“X”为标记)作为PCR反应的扩增引物。单一的限性酶切位点已给出。图4.具密码子-偏倚性的LqhIT2基因的核酸序列及相应氨基酸序列。核酸序列中的小写字(核苷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：B·F·麦卡琴，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：
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