合成的HIV基因制造技术

提供编码ＨＩＶ基因的合成ＤＮＡ分子和ＨＩＶ基因的修饰。所述合成分子的密码子用预定宿主细胞优选的密码子。所述合成分子可作为多核苷酸疫苗使用，这种疫苗通过中和抗体和细胞介导的免疫，来提供针对ＨＩＶ感染的有效免疫预防。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请的相互参照这是于1996年2月22日申请的美国序号60/012,082相关的非临时申请。关于联邦资助的R&D的声明不适用微缩胶片附录的参照不适用专利
HIV疫苗专利技术背景1．HIV感染人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)是获得性人类免疫缺陷综合症(AIDS)和相关失调的致病剂。HIV是逆转录病毒家族的一种RNA病毒，并表现出所有逆转录病毒的5’LTR-gag-pol-env-LTR3’结构。另外，HIV-1包含少数具有调节或未知功能的基因，包括tat和REV基因。env基因编码病毒被膜糖蛋白，这种糖蛋白作为160千道尔顿(kDa)的前体(gp160)翻译，然后被细胞蛋白酶酶切，产生外部120-kDa被膜糖蛋白(gp120)和跨膜41-kDa被膜糖蛋白(gp41)。gp120和gp41保持相连并且呈现在病毒颗粒和HIV感染的细胞表面上。gp120与存在于辅助T-淋巴细胞、巨噬细胞和其它靶细胞表面上的CD4受体结合。gp120与CD4结合后，gp41介导负责病毒侵入的融合事件。当病毒粒子上的gp120与T4淋巴细胞或其它靶细胞表面上的CD4受体结合时，感染开始。结合的病毒与靶细胞融合，并逆转录它的RNA基因组到细胞的的双链DNA中。病毒DNA被整合到细胞核的遗传物质中，在那里病毒DNA指导新病毒RNA、病毒蛋白质和新病毒粒子的产生。新粒子从靶细胞膜上芽生，并感染其它细胞。对免疫防御很关键的T淋巴细胞的破坏是作为HIV感染标志的进行性免疫机能障碍的主要原因。靶细胞的丧失严重地损坏了机体对大部分侵入者的抵抗能力，但它对于针对病毒、真菌、寄生虫和包括分枝杆菌的某些细菌的防御有特别严重的影响。HIV-1通过复制、从细胞中芽生和损坏细胞膜杀伤它感染的细胞。HIV可能间接地利用呈现在被感染细胞表面上的病毒gp120来杀伤靶细胞。因为T细胞上的CD4受体对gp120有强的亲合力，表达CD4受体的健康细胞可以结合gp120，并与被感染细胞融合形成合胞体。合胞体不能存活。HIV还能引起针对被感染细胞的正常细胞免疫防御。有或没有抗体的协助，细胞毒性的防御细胞都能够破坏在其表面呈现病毒蛋白质的被感染细胞。最后，游离的gp120能在感染有HIV的个体的血液中循环。游离的蛋白质能结合到未感染细胞的CD4受体上，使它们看来似乎被感染，因此引起免疫应答。HIV-1感染几乎都是致命的，目前还没有HIV-1感染的治疗方法。也没有得到预防HIV-1感染的有效疫苗。活的减毒病毒因为有回复或感染的危险，不能作为疫苗使用。大多数亚单位疫苗方法尚未成功地预防HIV感染。对于HIV感染的治疗，尽管延长一些被感染的人的生命，但有严重的副作用。因此很需要有效的治疗和疫苗，来与这种致命的感染作斗争。2．疫苗接种疫苗是疾病预防的一种有效形式，并已证明能成功地抵抗几种类型的病毒感染。决定把HIV-1抗原提呈给人免疫系统以便引起保护性体液免疫和细胞免疫的方法是一项困难的工作。到目前为止，试图生产有效的HIV疫苗还未成功。在AIDS病人中，游离的病毒仅以低水平出现。HIV-1的传染被通过融合和合胞体形成的细胞与细胞的相互作用所加强。因此，针对游离病毒或病毒亚基所产生的抗体一般对消除病毒感染的细胞无效。疫苗利用机体的“记忆”抗原的能力。第一次与给定的抗原相遇后，免疫系统就产生在个体的一生中保持该抗原免疫学记忆的细胞。以后接触该抗原就刺激免疫应答，并导致消除或灭活该病原体。免疫系统以两种方式对付病原体通过体液应答和通过细胞-介导的应答。在体液应答中，淋巴细胞产生与该抗原结合的专一性抗体，由此使病原体失活。细胞介导的应答涉及细胞毒性和专一性攻击和消灭被感染细胞的协助T淋巴细胞。用HIV-1病毒研制的疫苗存在一些问题，因为HIV-1感染一些在免疫系统中疫苗需要激活的相同的细胞(如T4淋巴细胞)。研制在免疫系统损害发生之前使HIV失活的疫苗是有益的。特别合适的一类型的HIV疫苗能产生识别HIV变异体的抗-HIV免疫应答，该免疫应答在处于感染开始时的HIV-阳性个体中起作用。研制针对病毒的疫苗的主要挑战是在不同的病毒分离物或毒株中的病毒被膜蛋白的多样性；特别是那些具有高突变率的病毒，例如人类免疫缺陷病毒，针对这种病毒诱出中和性和保护性免疫应答是合乎需要的。因为在小鼠和人类中的细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)能够识别得自保守的内部病毒蛋白质的抗原决定基，被认为在针对病毒的免疫应答中是重要的，因此已做了研制能够提供针对不同病毒株的异源性保护的CTL疫苗的努力。已经知道CD8+CTL当其T细胞受体识别与MHCⅠ型分子相结合的病毒肽时，杀伤病毒感染的细胞。这些病毒肽得自内源性合成的病毒蛋白质，与该蛋白质在病毒中的定位或功能无关。这样，CTL通过识别来自保守的病毒蛋白的抗原决定基，可提供交叉毒株保护。能够与用于CTL识别的MHCⅠ型结合的肽来源于存在于或穿过细胞质或内质网的蛋白质，一般来说，进入核内体加工途径的外源性蛋白质(如在由MHCⅡ型分子呈递的抗原的情况下)在产生CD8+CTL应答中无效。产生CTL应答的大多数尝试已用复制型载体在细胞内产生蛋白质抗原，或这些尝试集中于将肽导入细胞胞质中。这些方法有一些限制，可减低它们作为疫苗的实用性。逆转录病毒载体在可以作为融合蛋白表达而同时保持重组体病毒复制能力的多肽的大小和结构上有限制，用于后续免疫接种的载体(例如牛痘)效力可被针对所述载体本身的免疫应答所损害。另外，病毒载体和修饰的病原体有在人类中阻碍其用途的固有的风险。此外，呈现出来的抗原决定基的选择依赖于个体的MHC抗原的结构，因此，由于在远系繁殖的群体中MHC单倍型的多样性，肽疫苗可能具有有限的功效。3．DNA疫苗Benvenisty,N.和Reshf.L(PNAS 83,9551-9555,(1986))显示腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v)或肌内(i.m.)导入小鼠中的CaCl2-沉淀的DNA能够被表达。在鼠中i.m.注射不用CaCl2处理的DNA表达载体导致肌肉细胞摄取DNA，并表达该DNA所编码的蛋白质。该质粒以附加体形式保持并且不复制。随后，在大鼠、鱼和灵长类骨骼肌和大鼠的心肌内i.m.注射后，已经观察到持续的表达。用核酸作为治疗剂的技术已在WO90/11092(1990年10月4日)中报道，其中裸露的多核苷酸用来接种脊椎动物。肌内免疫方法的成功不是必须的。将覆盖有编码牛生长激素(BGH)的DNA的金微弹导入小鼠皮肤中，导致鼠中抗-BGH抗体的产生。喷射注射器已用来转染活动物的皮肤、肌肉、脂肪和乳房组织。导入核的不同方法已有综述。Zhu显示了在小鼠中静脉内注射DNA阳离子脂质体复合物(Science 261:209-211(1993年7月9日)产生克隆的转移基因的系统表达。Ulmer等(Science 259:1745-1749,(1993))报道了通过肌肉内注射编码病毒蛋白的DNA异源性保护抵抗流感病毒感染。本专利技术满足对能够引起对病原体和肿瘤抗原所需免疫应答的专一性治疗剂和预防剂的需要。在这种治疗方法中特别重要的是诱导T细胞免疫应答的能力，这种免疫应答可以预防感染或甚至由与获取该抗原基因的毒株异源的病毒毒株引起的疾病。当处理HIV时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
合成的多核苷酸，包含编码ＨＩＶ ｅｎｖ蛋白或其片段的ＤＮＡ序列，该ＤＮＡ序列包含最适宜在哺乳动物宿主中表达的密码子。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：JW施维尔，ME达维斯，DC弗雷德，MA刘，HC佩尔赖，
申请(专利权)人：麦克公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]