肿瘤标志物的组合检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤标志物的组合检测方法，所述方法包括：1)提供来自检查对象的样本，所述检查对象为人；2)对步骤1)所述的样本进行检测，所述检测为测定Septin9基因是否存在甲基化以及测定蛋白质肿瘤标志物是否存在。本发明专利技术将不同的肿瘤标志物形成组合检测，提高了肿瘤早期检测的灵敏性。

【技术实现步骤摘要】
肿瘤标志物的组合检测方法及其应用
本专利技术涉及基因检测，尤其涉及将基因肿瘤标识物与蛋白质肿瘤标志物相结合用于疾病的体外辅助诊断的肿瘤标志物的组合检测方法及其应用。
技术介绍
癌症是全球主要的死亡原因之一：2004年，全球癌症死亡人数达740万(约占所有死亡人数的13％)，全球癌症死亡人数将继续增加，2030年，死亡人数预计将达1200万。全世界2005年至2015年期间有8400万人左右死于癌症，每年导致癌症总死亡率的主要癌症种类为：肺癌(130万)、胃癌(80.3万)、结肠癌(63.9万)、肝癌(61万)和乳癌(51.9万)。2015年美国共有170万新发癌症病例。2015年预估中国每年新发癌症病例约为429.16万例，死亡281.42万例，占新发病例65.6％。2015年预估中国每年新发癌症病例的主要癌症种类为肺癌(73.33万)、胃癌(67.91万)、食管癌(47.79万)、肝癌(46.61万)、结直肠癌(37.63万)和乳癌(27.24万)。2015年预估中国每年导致癌症总死亡率的主要癌症种类为：肺癌(61.02万)、胃癌(49.80万)、肝癌(42.2万)、食管癌(37.5万)、结直肠癌(19.1万)、胰腺癌(7.94万)、和乳癌(7.07万死亡)。肿瘤是一种全身性疾病，几乎可以发生在身体的所有部位，肿瘤包括恶性肿瘤和良性肿瘤，恶性肿瘤中大多数是癌症。目前危害人类的主要肿瘤有肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌和食道癌，其他常见的肿瘤有子宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、甲状腺癌、淋巴瘤，子宫体癌、卵巢癌和脑瘤等。全世界最常见的癌症种类(按全球死亡人数排序)为：男性：肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、食道癌和前列腺癌。女性：乳癌、肺癌、胃癌、结肠直肠癌和子宫颈癌。中国的排序略有不同，2015年中国男性五种最常见肿瘤依次肺癌、胃癌、食管癌、肝癌和结直肠癌，这五种癌占所有癌症病例的2/3。女性最常见肿瘤依次乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌和食管癌，占所有癌症病例的60％。2015年中国主要癌症的总死亡人数排序为肺癌(21.68％)、胃癌(17.7％)、肝癌(15.0％)、食道癌(13.33％)、结肠直肠癌(6.79％)、胰腺癌(2.82))和乳腺癌(2.51％)。人类经过和肿瘤的艰苦和漫长博弈，认识到对III-IV期的晚期肿瘤来说，即使经过各种复杂的手术治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗、基因治疗、靶向治疗等，5年存活率只有5-15％；而对I-II期的早期肿瘤，5年存活率可达80-90％，癌前病变或称0期癌或原位癌的治疗效果更好。所以，近年来业界的共识是要早期发现和早期干预肿瘤，这才是解决肿瘤的根本措施。临床研究发现，多数癌症从病灶开始形成，到患者出现临床症状的过程平均需要数年时间，这为发现早期癌症、提高早期癌症的确诊率提供了一个有效的窗口期。因此，充分利用这个窗口期，研发灵敏、准确、无创、方便的早期癌症的检测和检查技术，提高早期癌症的发现率，是改善癌症治疗效果、降低癌症死亡率的重要途径。遗憾的是在肿瘤早期检查或癌前病变的检查中，由于没有明显的受检者的主诉、临床症状和体征，难以针对性的选择相应的临床辅助检查如X-线透视、CT、MRI、超声波、或腔镜检查。这些传统方法由于检测技术的限制，对早期癌症的灵敏性和特异性低，例如低剂量螺旋CT检测肺癌的假阳性率高，提高了过度治疗的风险，并且操作复杂、侵入性强(如：肠镜、胃镜等)。检测成本高(如：CT、MRI需要昂贵的设备和专业培训的技术人员)是用于肿瘤早期检查的明显障碍，而且仅对单一癌症进行检测，不适用于多种癌症的早期检查。在众多的检测方法中，人们很难选择出有针对性的检测方法来早期的检测某出某一种肿瘤，同时能排除其他肿瘤的可能性。由于受检者都是没有症状的大量的正常(无病)人群，对受检者来说，肿瘤检测要采样方便，样品需求量少，对受检者没有痛苦和伤害，价格适当，容易被受检者接受。对施行肿瘤检测的机构来说，检测方法要简单快速，对检测设备、场地和人员的没有过分要求，容易实现。这就需要一种从检测技术上具有特异、广谱、灵敏和能从血液中检测早期癌症的方法，从普及施行上简易、方便和减少受检者负担的检测方法。传统的蛋白质肿瘤标志物已经广为使用，但对多种肿瘤精准的早期检测尚不尽人意。甲胎蛋白(α-fetoprotein，αFP或AFP)是一个特异性较强的蛋白质肿瘤标志物，可以在大约80％的肝癌患者血清中升高，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，一直认为是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。但该检测只能检测原发性肝癌，对其他癌症则检测效果有限，单独使用特异性较强的肿瘤标志物，如甲胎蛋白检测，就会漏掉上述其他的癌症。为了不漏掉其他肿瘤，可以采用广谱性肿瘤标志物来检测早期肿瘤。癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，CEA)是一个广谱性肿瘤标志物，除原发性结肠癌、乳腺癌和肺癌以外，胰腺癌、胆管癌、胃癌、食管癌、粘液腺癌和泌尿系统的肿瘤阳性率也升高，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对结直肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物，但业界公认的是其特异性不强，灵敏度不高，对肿瘤早期诊断作用不明显。为了兼顾广谱性、特异性、灵敏性和能从血液中检测早期癌症这些技术要求，相比甲胎蛋白和癌胚抗原这些传统的蛋白质肿瘤标志物来说，检测核酸肿瘤标志物被公认为符合上述技术要求。尤其能从血液中检测到肿瘤释放出的DNA，起到液体活检(LiquidBiopsy)的作用。常用的核酸检测技术有固相芯片、液相芯片、实时定量PCR(PolymeraseChainReaction)、数字PCR、SangerDNA测序和高通量DNA测序(“Next-generation”sequencing)等。上述这些核酸检测方法中，以高通量DNA测序最符合兼顾广谱性、特异性、灵敏性和能从血液中检测早期癌症这些技术要求，高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对一个肿瘤的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。但高通量DNA测序对检测设备、场地和人员的有很高的要求，不容易实现，不符合对检测方法的简易和方便的要求。目前高通量DNA测序价格偏贵，对受检者形成负担，不一定适合没有症状的大量的正常(无病)受检者。实时定量PCR除兼顾广谱性、特异性、灵敏性和能从血液中检测早期癌症这些技术要求外，还在施行肿瘤检测的机构中有广泛普及，价格合适，不会对受检者形成负担，适合没有症状的大量的正常(无病)受检者。除了合适的技术平台外，能兼顾广谱性、特异性、灵敏性和能从血液中检测早期癌症这些技术要求核酸肿瘤标志物更为重要。
技术实现思路
基于上述
技术介绍
，本专利技术的目的在于提供一种通过综合分析基因甲基化谱(methylome)和蛋白质肿瘤标志物数据，用于疾病的体外辅助诊断的肿瘤标志物的组合检测方法。本专利技术提供了一种肿瘤标志物的组合检测方法，所述方法包括：1)提供来自检查对象的样本，优选地，所述检查对象为人；2)对步骤1)所述的样本进行检测，所述检测为测定Septin9基因是否存在甲基化以及测定蛋白质肿瘤标志物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤标志物的组合检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：1)提供来自检查对象的样本，优选地，所述检查对象为人；2)对步骤1)所述的样本进行检测，所述检测为测定Septin9基因是否存在甲基化以及测定蛋白质肿瘤标志物是否存在；其中，所述样本选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞；从血液中分离的细胞、体液、痰液、咽拭子，或其组合；优选地选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种；所述蛋白质肿瘤标志物选自脑癌、胃癌、肝癌、食管癌、宫颈癌、甲状腺癌、淋巴癌、膀胱癌、白血病、肾癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌或子宫癌的蛋白质肿瘤标志物中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤标志物的组合检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：1)提供来自检查对象的样本，优选地，所述检查对象为人；2)对步骤1)所述的样本进行检测，所述检测为测定Septin9基因是否存在甲基化以及测定蛋白质肿瘤标志物是否存在；其中，所述样本选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞；从血液中分离的细胞、体液、痰液、咽拭子，或其组合；优选地选自结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种；所述蛋白质肿瘤标志物选自脑癌、胃癌、肝癌、食管癌、宫颈癌、甲状腺癌、淋巴癌、膀胱癌、白血病、肾癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌或子宫癌的蛋白质肿瘤标志物中的一种或多种。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述Septin9基因甲基化的测定是通过实时定量PCR实现的。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述实时定量PCR中的上游引物序列为SEQIDNO:1；下游引物序列为SEQIDNO:2；阻断剂序列为SEQIDNO:3；探针序列为SEQIDNO:4和SEQIDNO:5；优选地，所述实时定量PCR以ACTB为内对照基因；更优选地，所述ACTB的上游引物序列为SEQIDNO:6；下游引物序列为SEQIDNO:7；探针序列为SEQIDNO:8；进一步优选地，所述实时定量PCR的反应程序为：阶段1：一个循环94℃，20分钟；阶段2：45个循环，62℃，5秒，55.5℃，35秒，93℃，30秒；阶段3：40℃，5秒。4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述蛋白质肿瘤标志物的测定方法选自液态芯片、固态芯片、酶联免疫、放射免疫、化学发光免疫、质谱、高效液相层析、Western印记和序列分析中的一种或多种。5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白质肿瘤标志物选自CEA、大便中血红蛋白、MG7、IDH1、CA199、甲胎蛋白(AFP)、CA125、CA72-4、CA242、CA50、Cyfra21-1、PSA、FPSA/TPSA、NSE、SCC、proGRP、PG、PGI/PGII、TPA、TPS、CA153、β-HCG、SF、H3K4me1、H3K4me3、H4K8ac、Auto-abp53中的一种或多种；在一个优选的实施方案中，所述蛋白质肿瘤标志物选自癌胚抗原、大便中血红蛋白、CA724、甲胎蛋白、CA242、CA199、Cyfra21-1、CA153、CA125、PSA和β-HCG中的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建铭，韩晓亮，徐海，马竣，宋乐乐，周光朋，
申请(专利权)人：博尔诚北京科技有限公司，博诚研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11