一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇技术

本发明专利技术公开了一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇，该生物合成方法高效，方便，包括：将blnR基因片段连入载体中，得到表达质粒；将表达质粒利用电转化转入根癌农杆菌EHA105，筛选培养，得到带有表达质粒的农杆菌；接种于液体培养基避光振荡培养，取培养液，然后再避光振荡培养，得到重组农杆菌EHA105菌液；收集大团囊虫草分生孢子，得到大团囊虫草菌分生孢子悬浮液；取重组农杆菌EHA105菌液和大团囊虫草菌分生孢子悬浮液混合，避光共培养，得到共培养混合菌体；得到OE::blnR大团囊虫草转化子，发酵培养，发酵液经分离得到化合物balanol。

【技术实现步骤摘要】
一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇
本专利技术涉及化合物balanol的生物合成
，具体涉及一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇。
技术介绍
真菌天然产物是人类天然药物来源的宝库，但很多基因簇在自然条件下是隐性的，近年来的许多新技术进展，包括测序、检测手段，使得激活新产物越来越容易。大团囊虫草是一种被用于治疗血崩、月经不调等病症的传统中药分布于亚洲、欧洲等。通过基因组测序，发现了大团囊虫草基因组序列中含有一个AflR调控因子的PKS-NRPS杂合基因簇，但在发酵产物中，没有检测到可以和该基因簇相对应的产物，推测其为一个隐形基因簇。通过构建其中的特异性调控因子blnR的过表达载体，经过液体摇瓶发酵培养和HPLC检测，确认激活了该PKS-NRPS混合基因簇，通过分离纯化，得到了balanol及其他新产物。化合物balanol的结构如下所示：balanol具有很强的PKC抑制剂活性，其三维结构与ATP相似，而其与PKC和PKA蛋白激酶的ATP结合口袋相结合的亲和力是ATP的3000倍，PKA和PKC是肿瘤学中的重要靶点。1993年balanol首先从真菌Verticilliumbalanoides中被分离鉴定，1994年确认了与1977年在大团囊虫草中发现的ophiocordin是同一种物质。因为真菌中的balanol天然产物量极少，为拓宽balanol的使用意义，balanol及其衍生物的化学合成，此前诸多研究对其进行了体外的化学全合成研究，而这些方法大都费时费力，本专利技术中的生物合成方法高效，方便，为后续的balanol结构及衍生物合成活性研究提供了新手段。
技术实现思路
本专利技术提供了一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇，该生物合成方法高效，方便，在真菌大团囊虫草(Tolypocladiumophioglossoides)中实现balanol高效生物合成的方法。本专利技术是利用农杆菌介导的T-DNA转化法构建大团囊虫草(Tolypocladiumophioglossoides)中的转化体系，过表达途径特异性调控因子blnR，激活原本在实验室条件下沉默的balanol合成基因簇，经液体发酵后通过HPLC检测发酵液中balanol的产生，经过分离纯化得到生物合成的balanol。一种化合物balanol的生物合成方法，包括以下步骤：1)将blnR基因片段连入载体中，得到表达质粒；2)将表达质粒利用电转化转入根癌农杆菌EHA105，经链霉素(Str)和卡那霉素抗性筛选培养，挑菌落PCR鉴定，得到带有表达质粒的农杆菌；3)将带有表达质粒的农杆菌单克隆接种于液体培养基避光振荡培养，取培养液，重悬菌体至OD6000.1-0.15，然后再避光振荡培养，使OD600达到0.5-0.6，得到重组农杆菌EHA105菌液；4)培养大团囊虫草，收集大团囊虫草分生孢子，经血球计数板计数调整孢子浓度至(0.5～5)*106个/ml，得到大团囊虫草菌分生孢子悬浮液；5)取重组农杆菌EHA105菌液和大团囊虫草菌分生孢子悬浮液混合，避光共培养，得到共培养混合菌体；6)用无菌水洗涤共培养混合菌体，之后涂布于平板上，倒置培养至转化子出现，将转化子转接到选择性平板上进行继代培养3-5次，经PCR鉴定，得到OE::blnR大团囊虫草转化子；7)将鉴定正确的OE::blnR大团囊虫草转化子发酵培养，发酵液经分离得到化合物balanol。以下作为本专利技术的优选技术方案：步骤1)中，所述的载体为含有pTEF强启动子和卡那霉素抗性基因(neo)及氯嘧磺隆抗性基因(SUR)的pFG载体。步骤2)中，根癌农杆菌EHA105采用市售产品，具体可采用上海唯地生物技术有限公司的产品。步骤3)中，所述的液体培养基为YEB培养基。采用含乙酰丁香酮的IM培养基重悬菌体。步骤4)中，大团囊虫草采用中国专利技术专利(专利号：ZL200410025774.6)公开的大团囊虫草菌无性型菌丝体，菌种保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCCNo.1146。调整孢子浓度至(0.5～2)*106个/ml，更进一步优选，调整孢子浓度至106个/ml。步骤5)中，所述的避光共培养的条件为：在24℃～28℃避光共培养36h～60h，进一步，在26℃避光共培养48h。步骤6)中，在24℃～28℃倒置培养至转化子出现，进一步在26℃倒置培养至转化子出现。将转化子转接到选择性平板上进行继代培养3-4次。步骤7)中，将鉴定正确的OE::blnR大团囊虫草转化子接种至COB培养基发酵培养，所述的COB培养基以1L计算：Polypeptone5g、Yeastextract5g、MgSO4.7H2O1g、KH2PO40.5g、Sucrose30g、余量为去离子水，最后pH5.5。得到的化合物经过高分辨质谱HR-MS(HighResolutionMassSpectrometer)检测，得到其在负离子模式[M-H]-下分子量为549.1514，拟合得到的分子式为C28H26N2O10。得到的化合物经核磁共振NMR得到其波谱数据与参考文献(Nicolaou,K.,M.E.Bunnage,andK.Koide,Totalsynthesisofbalanol.JournaloftheAmericanChemicalSociety,1994.116(18):p.8402-8403)吻合，确定结构为化合物balanol。专利技术人前期从西双版纳丛林中采集到大团囊虫草菌子实体，从中分离到大团囊虫草菌无性型菌丝体，菌种保存在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCCNo.1146，获授权国家专利技术专利(专利号：ZL200410025774.6)。通过对该菌株进行摇瓶培养，提取基因组DNA，测序后分析得到一个PKS-NRPS混合型合成基因簇并首次证实其是balanol的生物合成基因簇如图1所示。该基因簇共18个基因，其中包含一个调控基因blnR，一个PKS合成基因blnA，及两个NRPS合成基因blnN和blnO，和其它修饰基因。blnR基因片段，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。一种蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。该蛋白质是由blnR基因片段表达得到。该氨基酸序列经过NCBI网站的blastn比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，为黄曲霉(Aspergillusflavus)中蛋白AflR的同源序列，是一种真菌特有的Zn2Cys6类型的调控蛋白。blnA基因片段(即PKS合成基因blnA)，其碱基序列如SEQIDNO：3所示。blnN基因片段(即NRPS合成基因blnN)，其碱基序列如SEQIDNO：4所示。blnO基因片段(即NRPS合成基因blnO)，其碱基序列如SEQIDNO：5所示。提取大团囊虫草的基因组DNA并进行PCR，得到blnR基因片段、blnA基因片段、blnN基因片段、blnO基因片段。基因簇，包括：碱基序列如SEQIDNO：1所示的blnR基因片段、碱基序列如SEQIDNO：3所示的blnA基因片段、碱基序列如SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化合物balanol的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将blnR基因片段连入载体中，得到表达质粒；2)将表达质粒利用电转化转入根癌农杆菌EHA105，经链霉素和卡那霉素抗性筛选培养，挑菌落PCR鉴定，得到带有表达质粒的农杆菌；3)将带有表达质粒的农杆菌单克隆接种于液体培养基避光振荡培养，取培养液，重悬菌体至OD6000.1‑0.15，然后再避光振荡培养，使OD600达到0.5‑0.6，得到重组农杆菌EHA105菌液；4)培养大团囊虫草，收集大团囊虫草分生孢子，经血球计数板计数调整孢子浓度至(0.5～5)*10

【技术特征摘要】
1.一种化合物balanol的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将blnR基因片段连入载体中，得到表达质粒；2)将表达质粒利用电转化转入根癌农杆菌EHA105，经链霉素和卡那霉素抗性筛选培养，挑菌落PCR鉴定，得到带有表达质粒的农杆菌；3)将带有表达质粒的农杆菌单克隆接种于液体培养基避光振荡培养，取培养液，重悬菌体至OD6000.1-0.15，然后再避光振荡培养，使OD600达到0.5-0.6，得到重组农杆菌EHA105菌液；4)培养大团囊虫草，收集大团囊虫草分生孢子，经血球计数板计数调整孢子浓度至(0.5～5)*106个/ml，得到大团囊虫草菌分生孢子悬浮液；5)取重组农杆菌EHA105菌液和大团囊虫草菌分生孢子悬浮液混合，避光共培养，得到共培养混合菌体；6)用无菌水洗涤共培养混合菌体，之后涂布于平板上，倒置培养至转化子出现，将转化子转接到选择性平板上进行继代培养3-5次，经PCR鉴定，得到OE::blnR大团囊虫草转化子；7)将鉴定正确的OE::blnR大团囊虫草转化子发酵培养，发酵液经分离得到化合物balanol。2.根据权利要求1所述的化合物ba...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永泉，陈新爱，何弦，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33