紫杉二烯过表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了紫杉二烯过表达载体及其应用，其中该载体包含：选自紫杉二烯合酶TS基因、idi基因和tHMG1基因的至少之一。将本发明专利技术的过表达载体转入产紫杉醇的真菌中，能够使该真菌过表达上述GGPP和紫杉二烯合成的关键基因，从而能够在产紫杉醇的真菌中实现前体物质GGPP和紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质，进而能够有效提高包含本发明专利技术的过表达载体的重组微生物的紫杉醇产率，以及发酵生产紫杉醇的代谢稳定性。

Paclitadiene overexpression vector and its application

The invention discloses a taxane overexpression vector and its application, wherein the carrier comprises: at least one selected from the taxane diene synthase TS gene, IDI gene and tHMG1 gene. The over expression vector into fungal taxol producing fungi, can make the expression of the key genes GGPP and taxadiene synthesis, thus can realize the precursors of GGPP and taxadiene accumulation in the taxol producing fungi, providing as much as possible precursors for subsequent metabolic intermediates the accumulation, and can effectively improve the invention comprising over expression vector of recombinant microorganism taxol yield, fermentation and production of taxol metabolic stability.

【技术实现步骤摘要】
紫杉二烯过表达载体及其应用
本专利技术涉及紫杉二烯过表达载体及其应用。
技术介绍
1963年美国科学家首次从一种太平洋杉树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物，并发现其对鼠肿瘤细胞有很高活性。后来通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇被广泛应用于卵巢癌和乳腺癌等癌症的治疗，是现在最有潜能且商业应用最为成熟的一种抗癌药。但随着逐年的砍伐以及生长速度的缓慢，可利用的红豆杉已经越来越少，使得红豆杉的供需失衡问题日趋严重，难以实现可持续商业化生产。现今主要通过化学半合成法生产紫杉醇：通过从红豆杉叶片等组织中提取中间产物如巴卡亭III、10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ等，随后通过化学合成生产紫杉醇，但该方法仍然没有摆脱对红豆杉的依赖，因而价格一直居高不下。利用微生物发酵生产人类所需目标化合物现今已经取得了可喜成果，因而也有很多科学家立志于寻找能产生紫杉醇的微生物来高效生产紫杉醇。自1993年Stierle等人发现了第一株能够产紫杉醇的真菌以来，人们已发现并报道了多个种属的真菌具有合成紫杉醇的能力。然而由于检测手段的缺陷以及代谢不稳定的问题则使得其难以被用于商业化生产。因而，目前代谢稳定，产率较高的紫杉醇产生菌的获得仍有待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种代谢稳定，产率较高的紫杉醇产生菌。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现和工作而完成的：紫杉醇产生菌TPF6为植物内生真菌，其对外界环境要求较为苛刻，存在着次级代谢不稳定的内生菌共性问题，严重影响着真菌产紫杉醇这一方向的科学研究及工业化应用。而由于以GGPP为底物的紫杉醇生物合成途径涉及19个酶促反应步骤，其中包含着紫杉二烯合酶以及一系列细胞色素P450羟化酶等限速步骤，这极大地限制了紫杉醇的高效生物合成。本专利技术通过对交链格孢体内涉及前体物质GGPP合成的MVA途径中的关键基因以及紫杉醇生物合成第一步所需的紫杉二烯合酶进行过表达，成功地在交链格孢体内实现了紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质。从而，专利技术人通过对真菌交链格孢(AlternariaalternataTPF6)进行一系列代谢工程改造实现了紫杉醇生物合成前体物质紫杉二烯的积累，使得紫杉二烯产量达到61.91±6.32μg/L，为紫杉醇的生物合成提供尽可能多的底物，从而使得紫杉醇的产率可以有效提高。由此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种紫杉二烯过表达载体。根据本专利技术的实施例，该载体包含：选自紫杉二烯合酶TS基因、idi基因和tHMG1基因的至少之一。其中，甲羟戊酸途径生成紫杉醇合成的前体物质香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，而其中将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmg1、将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi均为甲羟戊酸途径的关键基因。紫杉二烯为紫杉醇生物合成第一步所需的底物，而将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸环化为紫杉二烯的紫杉二烯合酶ts基因则是紫杉二烯合成的关键基因。由此，将本专利技术的过表达载体转入产紫杉醇的真菌中，能够使该真菌过表达上述GGPP和紫杉二烯合成的关键基因，从而能够在产紫杉醇的真菌中实现前体物质GGPP和紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质，进而能够有效提高包含本专利技术的过表达载体的重组微生物的紫杉醇产率，以及发酵生产紫杉醇的代谢稳定性。根据本专利技术的实施例，所述载体为质粒。根据本专利技术的实施例，所述紫杉二烯合酶TS基因的核酸序列如SEQIDNO.8所示，所述idi基因的核酸序列如SEQIDNO.10所示，所述tHMG1基因预先经过TPF6密码子优化，其核酸序列如SEQIDNO.12所示。由此，基因表达效率高。根据本专利技术的实施例，进一步包含启动子和终止子。根据本专利技术的实施例，所述启动子为选自alcA、agdA、glaA、trpC、gpdA和oliC的至少之一，优选alcA、trpC和oliC的至少之一。其中，需要说明的是，专利技术人进行了一系列实验，选择绿色荧光蛋白(GFP)作为启动子强度的筛选标记，分别将其置于不同来源的启动子控制下，以研究不同来源启动子在TPF6体内的启动基因表达能力。结果发现，启动子alcA在交链格孢体内具有最强的启动子强度，可用于需要高表达量蛋白的精确控制，而诱导型启动子agdA，glaA以及组成型启动子trpC，gpdA和oliC之间无明显的差别，适合于中等强度的基因的表达。因而，当本专利技术的过表达载体选择上述启动子时，转入TPF6后表达效果突出。根据本专利技术的实施例，所述终止子为选自CAMV，agdA、niaD和NOS的至少之一。根据本专利技术的实施例，进一步包含卡那霉素筛选基因、潮霉素筛选基因、头孢霉素筛选基因。在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种重组微生物，所述微生物为紫杉醇产生菌。根据本专利技术的实施例，该重组微生物包含前面所述的紫杉二烯过表达载体。由此，本专利技术的包含前述过表达载体的重组微生物能够过表达GGPP和紫杉二烯合成的关键基因，从而能够实现前体物质GGPP和紫杉二烯的积累，为后续代谢中间产物的积累提供尽可能多的前体物质，进而能够有效提高紫杉醇产率以及发酵生产紫杉醇的代谢稳定性。根据本专利技术的实施例，所述微生物为交链格孢。在本专利技术的第三方面，本专利技术提供了一种制备重组微生物的方法，所述微生物为紫杉醇产生菌。根据本专利技术的实施例，该方法包括：将前面所述的紫杉二烯过表达载体导入野生型的微生物。由此，能够有效获得前面所述的能够过表达GGPP和紫杉二烯合成的关键基因的本专利技术的重组微生物。根据本专利技术的实施例，所述微生物为交链格孢，所述方法包括以下步骤：利用钙转的方法将前面所述的紫杉二烯过表达载体转化到农杆菌感受态细胞中；挑取转化子，并转接到含有第一筛选药物的LB培养基中，28℃过夜培养，使得OD达到0.8～1.2；离心收集菌体，并用IM培养基稀释农杆菌至OD600为0.5，再在28℃下培养6h，以便获得农杆菌菌液；利用所述农杆菌菌液将交链格孢孢子稀释至浓度为105个/mL，以便获得混合菌液；吸取混合菌液涂布于铺有玻璃纸Co-IM的平板上，25℃共培养3d，其中所述Co-IM培养基是通过在IM培养基中添加1g/L葡萄糖，0.4mmol/L乙酰丁香酮，20g/L琼脂获得的；将经过共培养的混合菌液倒入含有第二和第三筛选药物的PDA培养基中，于28℃下进行筛选培养；将所述筛选培养中生长出来的转化子挑取到无菌PDA平板上，进行传代培养；以及将经过传代培养的转化子进行PCR验证筛选，以便获得最终转化子，所述最终转化子即为重组交链格孢。由此，转化效率高，获得的转化子阳性率高。其中，所述IM培养基包含：0.5g/LNH4NO3，0.3g/LNaCl，0.01g/LCaCl2·2H2O，0.6g/LMgSO4·7H2O，0.136g/LKH2PO4，0.5mg/LCuSO4·5H2O，0.5mg/LZnSO4·7H2O，0.5mg/LH3BO3，0.5mg/LNa2MoO4·2H2O，1.3mg/LNa2-EDTA·2H2O，1mg/LFeSO4·7H2O，6.3g/Lglycerol，8.5g/LMES，2g/L葡萄糖，0.2mmol/L乙酰丁香酮。根据本专利技术的实施例，所述第一筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种紫杉二烯过表达载体，其特征在于，包含：选自紫杉二烯合酶TS基因、idi基因和tHMG1基因的至少之一。

【技术特征摘要】
1.一种紫杉二烯过表达载体，其特征在于，包含：选自紫杉二烯合酶TS基因、idi基因和tHMG1基因的至少之一。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体为质粒，任选地，所述紫杉二烯合酶TS基因的核酸序列如SEQIDNO.8所示，所述idi基因的核酸序列如SEQIDNO.10所示，所述tHMG1基因预先经过TPF6密码子优化，其核酸序列如SEQIDNO.12所示。3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，进一步包含启动子和终止子。4.据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述启动子为选自alcA、agdA、glaA、trpC、gpdA和oliC的至少之一，优选alcA、trpC和oliC的至少之一，任选地，所述终止子为选自CAMV，agdA、niaD和NOS的至少之一。5.据权利要求3所述的载体，其特征在于，进一步包含卡那霉素筛选基因、潮霉素筛选基因、头孢霉素筛选基因。6.一种重组微生物，所述微生物为紫杉醇产生菌，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的紫杉二烯过表达载体，优选地，所述微生物为交链格孢。7.一种制备重组微生物的方法，所述微生物为紫杉醇产生菌，其特征在于，包括：将权利要求1-5任一项所述的紫杉二烯过表达载体导入野生型的微生物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微生物为交链格孢，所述方法包括以下步骤：利用钙转的方法将权利要求1-5任一项所述的紫杉二烯过表达载体转化到农杆菌感受态细胞中；挑取转化子，并转接到含...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，卞光凯，傅帅，苑玉杰，
申请(专利权)人：武汉臻智生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42