真菌基因组修饰系统及使用方法技术方案

提供了用于在丝状真菌细胞基因组中的靶位点处进行基因组修饰的组合物和方法。这些方法和组合物涉及用于在丝状真菌宿主细胞基因组中的靶位点处促进DNA序列的修饰的指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统。

Fungal genome modification systems and methods of use

Compositions and methods for genome modification at target sites in filamentous fungal cell genomes are provided. These methods and compositions relate to the guidance of the polynucleotide /Cas endonuclease system to facilitate the modification of DNA sequences at the target site in the filamentous fungal host cell genome.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】真菌基因组修饰系统及使用方法相关申请的交叉引用本申请要求全部在2014年12月16日提交的PCT专利申请系列号PCT/CN2014/093918、PCT/CN2014/093916、和PCT/CN2014/093914的优先权，这些专利以其全文通过引用并入本文。序列表将按照37C.F.R.§1.52(e)、经由EFS提交的序列表通过引用结合在此。经由EFS提交的序列表文本文件包含于2015年12月13日创建的文件“40532-WO-PCT-6_2015-868_Final_ST25.txt”，其大小为151千字节。专利技术背景细菌和古生菌已经演变出称为成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统的适应性免疫防御，这些系统能以序列特异性方式在DNA中引入双链断裂。Cas系统通过核糖核蛋白复合物的活性来发挥其功能，该核糖核蛋白复合物包含靶向特异性DNA序列(通过与称为可变靶向结构域的crRNA的一部分的同源性)并在靶标中产生双链断裂的短RNA序列(tracrRNA和crRNA)和RNA依赖型内切核酸酶(Cas内切核酸酶)。CRISPR基因座首先在大肠杆菌中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在丝状真菌细胞基因组中的靶位点处修饰DNA序列的方法，该方法包括：a)向丝状真菌细胞群体中引入Cas内切核酸酶和指导RNA，其中该Cas内切核酸酶和指导RNA能够形成复合物，该复合物使得该Cas内切核酸酶能够在该真菌细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂；并且b)从该群体鉴定在该靶位点处具有DNA序列的修饰的至少一个真菌细胞，其中将该Cas内切核酸酶、该指导RNA、或二者瞬时引入该真菌细胞群体中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.16 CN PCT/CN2014/093914;2014.12.16 CN PCT/1.一种用于在丝状真菌细胞基因组中的靶位点处修饰DNA序列的方法，该方法包括：a)向丝状真菌细胞群体中引入Cas内切核酸酶和指导RNA，其中该Cas内切核酸酶和指导RNA能够形成复合物，该复合物使得该Cas内切核酸酶能够在该真菌细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂；并且b)从该群体鉴定在该靶位点处具有DNA序列的修饰的至少一个真菌细胞，其中将该Cas内切核酸酶、该指导RNA、或二者瞬时引入该真菌细胞群体中。2.如权利要求1所述的方法，其中在所述靶位点处的DNA序列的修饰选自下组，该组由以下各项组成：一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的取代、及其任何组合。3.如权利要求1或2所述的方法，其中使用选自下组的方法实现将该Cas内切核酸酶引入该真菌细胞群体中，该组由以下各项组成：转染、转导、转化、电穿孔、粒子轰击(生物射弹粒子递送)、和细胞融合技术。4.如任一前述权利要求所述的方法，其中使用选自下组的方法实现将该指导RNA引入该真菌细胞群体中，该组由以下各项组成：转染、转导、转化、电穿孔、粒子轰击(生物射弹粒子递送)、和细胞融合技术。5.如任一前述权利要求所述的方法，其中该鉴定步骤包括在用于对该靶位点处的DNA序列的修饰进行选择或筛选的条件下培养来自步骤(a)的真菌细胞群体。6.如任一前述权利要求所述的方法，其中该鉴定步骤包括在用于筛选不稳定转化体的条件下培养来自步骤(a)的细胞群体。7.如任一前述权利要求所述的方法，其中该Cas内切核酸酶是Cas9内切核酸酶或其变体。8.如权利要求7所述的方法，其中该Cas9内切核酸酶或其变体包含来自选自下组的物种的全长Cas9或其功能片段，该组由以下各项组成：链球菌属物种(Streptococcussp.)，化脓性链球菌(S.pyogenes)、变异链球菌(S.mutans)、嗜热链球菌(S.thermophilus)；弯曲杆菌属物种(Campylobactersp.)，空肠弯曲杆菌(C.jejuni)；奈瑟氏菌属物种(Neisseriasp.)，脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)；弗朗西斯氏菌属物种(Francisellasp.)，新凶手弗朗西斯氏菌(F.novicida)；和巴斯德菌属物种(Pasteurellasp.)，多杀巴斯德菌(P.multocida)。9.如权利要求8所述的方法，其中该Cas9内切核酸酶或其变体包含与SEQIDNO:1至7中任一项具有至少70％同一性的氨基酸序列。10.如任一前述权利要求所述的方法，其中该引入步骤包括将包含该Cas内切核酸酶的表达盒的DNA构建体引入该真菌细胞中。11.如任一前述权利要求所述的方法，其中该引入步骤包括将包含该指导RNA的表达盒的DNA构建体引入该真菌细胞中。12.如权利要求1至9和11中任一项所述的方法，其中该引入步骤包括直接将该Cas内切核酸酶引入该真菌细胞中。13.如权利要求1至10和12中任一项所述的方法，其中该引入步骤包括直接将该指导RNA引入该真菌细胞中。14.如权利要求10所述的方法，其中该Cas内切核酸酶的表达盒包含针对在该真菌细胞中的表达所优化的Cas编码序列。15.如权利要求14所述的方法，其中该Cas编码序列是包含与SEQIDNO:8至少70％同一的多核苷酸序列的Cas9编码序列。16.如任一前述权利要求所述的方法，其中该Cas内切核酸酶有效地连接到核定位信号上。17.如权利要求11所述的方法，其中该指导RNA的表达盒包含在真子囊菌纲(Euascomycete)或盘菌纲(Pezizomycete)中具有功能的RNA聚合酶III依赖型启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·S·鲍尔，J·陈，葛晶，X·顾，S·S·金，S·M·马德里，D·宋，M·宋，M·沃德，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国,US