三磷酸腺苷-敏感性钾通道基因缺陷型动物的组织和细胞制造技术

提供了Ｋｉｒ６．２基因缺陷型的非人哺乳动物（尤其是小鼠），及其组织和细胞，其中在一个或两个等位基因座上缺失了ＡＴＰ－敏感性钾通道Ｋｉｔ６．２基因，它是胰腺β－细胞分泌胰岛素所必需的Ｋ↓［ＡＴＰ］通道的一个亚基。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基因缺陷型(剔除(knockout))动物，具体地涉及基因缺陷型小鼠，而且首先涉及三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道基因缺陷型小鼠。胰岛素是由胰腺β-细胞所分泌的，它是一种降低血中葡萄糖水平的激素，而葡萄糖是胰岛素分泌的重要生理刺激物之一。在过去的二十多年内，已经对葡萄糖诱导的胰岛素分泌机制进行了充分研究，其中主要是以葡萄糖代谢假设为基础(Malaisse WJ.等人，代谢(Metabolism),28:373-386(1979))。这个假设已经引起了广泛的注意，它强调了在胰腺β-细胞中葡萄糖代谢产物作为胰岛素分泌信号的可能性。在各种不同的代谢产物中，ATP被认为是最重要的分子之一，它所起的作用是作为代谢能量载体，作为胰腺β-细胞分泌胰岛素的胞内信号(Ashcroft,SJH，生物化学杂志(Biochem.J.),132:223-231(1973))。胰腺β-细胞是电生理可兴奋细胞，而且已知β-细胞的膜电位是胰岛素释放中刺激-分泌偶联过程中的关键因素(Henquin JC.,实验(Experimentia),40:1043-1052(1984))。还已知，葡萄糖通过控制膜对钾离子的通透性来调控β-细胞膜电位(Sehlin,J.，糖尿病(Diabetes)32:320-323(1983))。之后，1984年，在Cook等人发现了ATP-敏感性钾通道(ATP-sensitivepotassium channel，简称为KATP)之后，先发现了一种使葡萄糖代谢与膜的钾通透性关联的分子(Cook,DL等人，自然(Nature),311:271-273(1984))。KATP通道最初是在心肌中发现的，它的特征是当胞内ATP浓度增加时，该通道被抑制(Noma,A.，自然(Nature)305:147-148(1983))。随后，在各种组织和细胞中发现了KATP通道，其中包括脑、垂体腺和骨骼肌(Ashcroft,FM，神经科学年报(Annu.Rev.Neurosci.),11:97-118(1988))。根据胰腺β-细胞的胰岛素分泌机制，由葡萄糖代谢所产生的ATP会导致KATP通道的关闭，这又导致β-细胞膜的去极化，这之后是电压依赖型钙通道开启，从而允许Ca2+流入β-细胞。这样所造成的胞内Ca2+浓度上升，就触发了依赖Ca2+的胰岛素分泌(Wollheim,CB等人，生理学综述(Physiol.Rev.),61:914-973(1981))。因此，将细胞的代谢状态与细胞膜电位相关联的β-细胞KATP通道，是关键性的分子，因而认为它们的作用是胞内的ATP-和ADP-传感器，从而调控膜的兴奋性。磺酰脲(Su剂)是一种促进胰岛素分泌的口服降血糖药，它是在治疗非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)中广泛使用的治疗剂，已表明磺酰脲可抑制β细胞KATP通道的活性(Sturges,NC等人，柳叶刀(Lancet),8453:474-475(1985),De Weille,J.，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:1312-1316(1988))。对KATP通道的电生理学研究已表明，它们的动力学和药理学特性在不同组织中是不同的，这暗示KATP在组织中有结构和功能上的差异(Terzic,A等人，Am.I.Physiol.,269:C525-C545(1995))。因为在胰腺β-细胞和分泌胰岛素的细胞系中KATP通道具有内向式整流(inward rectification)的特性，因此，它们在结构上可能与构成内向式整流K+通道家族的其他通道有关。内向式整流K+通道与电压门控型K通道(Kv)的区别在于前者并不被膜的去极化所激活而且它们允许K+的流入大于流出。在了解内向式整流K+通道的结构和功能的过程中，由于表达克隆了编码3种截然不同的内向式整流K+通道的cDNA而获得了突破这3种K+通道是来自大鼠肾脏的ROMK1(Kir1.1)(Ho,K.等人，自然(Nature),362:31-38(1993))、来自小鼠巨噬细胞系的IRK1(Kir2.1)(Kubo,Y等人，自然(Nature),362:127-133(1993))和来自大鼠心脏的KGA(Kir3.1)(Dascal,N等人，美国科学院院报(Proe.Natl.Acad.Sci.USA),90:10235-10239(1993))。这些研究确立了新的Kir家族基因，它们编码结构和功能特征不同于Kv超家族的蛋白质。现在，根据Chandy和Gutman的命名，Kir亚家族被命名为Kir1.0-7.0(Chandy,KG.,Gutman,GA.，药理科学趋势(Trends Pharmacol.Sci.),14:434(1993)；Krapivinsky,G.等人，神经元(Neuron),20,995-1005(1998))。将GIRK1 cDNA作为探针，已从各种组织中分离出Kir家族的一个新成员，uKATP-1(Kir6.1)(Inagaki,N.，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),270:5691-5694(1995))。而且，通过将Kir6.1 cDNA用作探针对人基因组文库进行筛选，还分离出一个新的Kir基因，人Kir6.2(也称为“BIR”)。此外，通过在标准杂交条件下筛选小鼠胰岛素分泌细胞系MIN6 cDNA文库的7×105空斑，还获得了小鼠Kir6.2(mBIR)基因，人和小鼠的该基因的DNA序列已经公开(日本未审查的专利出版物77796/97)。小鼠Kir6.2基因的DNA序列示于序列表(SEQ ID NO:1)中。Kir6.2由390个氨基酸残基构成，在人Kir6.2和小鼠Kir6.2之间有96％相同性。此外，Aguilar-Bryan等人在克隆Kir6.2(BIR)的过程中发现了磺酰脲受体(SUR)(Aguilar-Bryan,L.等人，科学(Science),268:423-426(1995))。现在已知道胰腺β-细胞KATP通道含有至少两个亚基，即Kir6.2(BIR)和磺酰脲受体(SUR)，而且发生于KATP通道基因的突变被认为是非胰岛素依赖性糖尿病的主要致病因素之一。对于内向整流型钾通道的多样性和功能，可参见Horio,Y.,Seikagaku,70(2),p.73-83(1998)，和Seino,S.等人，糖尿病综述(Diabetes Reviews),4(2),177-190(1996)。现在，糖尿病是一种全国性疾病，在日本和美国，包括潜在病人在内的病人数目已经到达了数百万，据估计，5-10％中年人或更高年龄的人是糖尿病患者。糖尿病被分为Ⅰ型即胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和Ⅱ型即非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)，而且非胰岛素依赖性的Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的90％以上。如上所述，非胰岛素依赖性糖尿病和ATP-敏感性钾通道之间的关系正逐渐地被阐明。然而，NIDDM的新治疗剂的开发却受到了障碍，因为无法获得所必需的实验动物，因而无法研究ATP-敏感性钾通道的生物作用以及在此基础上开发非胰岛素依赖性糖尿病的改良治疗剂。另一方面，产生特定基因发生突变的模型动物，是研究导致多种病理状态的基因功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯合的Ｋｉｒ６．２基因缺陷型非人哺乳动物，其特征在于，两个等位基因座上都缺失了ＡＴＰ－敏感性钾通道Ｋｉｒ６．２基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：清野进，三木隆司，宫崎纯一，
申请(专利权)人：日本化学研究株式会社，清野进，
类型：发明
国别省市：JP[日本]