通过抑制内源海藻糖酶水平来修饰海藻糖-6-磷酸水平从而调节代谢制造技术

本发明专利技术在细胞代谢碳流调节领域内。已经发现导入细胞内糖类海藻糖－６－磷酸（Ｔ－６－Ｐ）有效来源的变化会诱导体内细胞、组织和器官的发育和／或组成的变化。这些变化可通过抑制内源海藻糖酶来诱导，该酶能够将海藻糖水解成两个葡萄糖组分。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

糖酵解是文献生化细节中最早描述的代谢过程之一。虽然生物中大致的碳水化合物流动是已知的并且所有糖酵解途径的酶已经阐明，但是通过刺激糖酵解来决定代谢诱导的信号还不清楚。已经提出了多个假说，特别是基于酵母中情况的假说，但是没有一个得到毫无疑问地证实。对碳水化合物分配方向的影响不仅直接影响细胞糖酵解和碳水化合物贮存的过程，而且也可以用于影响次级或衍生过程如细胞分裂、生物量产生和贮存化合物的积累，由此决定生长和产量。尤其在植物中，组织特性通常直接受碳水化合物存在的影响，并且控制碳水化合物的分配可带来实质不同。植物的生长、发育和产量依赖于该植物在光合作用过程中可从CO2固定得到的能量。光合作用主要发生于叶片并且以更低的程度发生于茎中，而其它植物器官如根、种子或块茎基本上对光同化过程不起作用。这些组织的生长和营养完全依赖于光合作用活性器官。那么这就意味着存在源自光合作用的产物(总称为“光合产物”)向植物无光合作用活性部分的流动。将光合作用活性部分命名为“源”并且将其定义为光合产物的净输出者。将光合作用无活性的部分命名为“库” 并且将其定义为光合产物的净输入者。一般认为植物中光合作用的效率以及碳水化合物的分配均是至关重要的。新的正在发育的组织如新叶片或其它部分如根和种子完全依赖于源中的光合作用。影响碳水化合物分配的可能性将对植物表型如其重量、节间距、叶片的大小和形状以及根系的大小和结构有重要影响。此外，光同化作用产物的分布对植物生物量和产物的产量极为重要。一个实例是上个世纪对小麦的开发。其光合能力没有显著改变但小麦谷物的产量大大增加，即收获指数(可收获生物量/总生物量)增加。根本原因是通过常规育种改变了库-到-源的比例，使得可收获的库即种子部分增加。然而，调节同化作用产物分布以及随后库与源形成的机制仍不清楚。据认为此机制在碳水化合物代谢途径及其调节的某些环节起作用。在最近的研究中，越来越明确己糖激酶在代谢物信号形成和代谢流控制中起主要作用。已经提出调节己糖激酶活性的众多机制(Gram等，(1994)，植物细胞6761；Jang & Sheen(1994)，植物细胞61665；Rose等，欧洲生化杂志199，511-518，1991；Blazquez等，(1993)，FEBS329，51；Koch，植物生理学和植物分子生物学年鉴(1996)47，509；Jang等，(1997)，植物细胞9，5)。已提出的酵母中己糖激酶调节的这些理论之一提到海藻糖及其相关单糖(Thevelein & Hohmann(1995)，TIBS 20，3)。然而，难以看到这将是普遍的机制，因为据信海藻糖合成只限于某些物种。WO 97/42326表明同时在海藻糖合成途径中的磷酸海藻糖合酶和磷酸海藻糖磷酸酶在转化入植物时可诱导代谢变化。在该申请中显示，细胞内海藻糖-6-磷酸水平被认为是关键的环节。仍然存在了解其它机制的需要，这些机制可影响海藻糖-6-磷酸并且因此可指导体内细胞、组织和器官的发育和/或组成的变化。专利技术概述本专利技术涉及通过抑制内源海藻糖水平来修饰体内细胞、组织或器官的发育和/或组成的方法。这些方法部分是通过抑制内源海藻糖水平来抑制细胞糖酵解方向中碳流的方法、通过抑制内源海藻糖水平刺激光合作用的方法、通过抑制内源海藻糖水平刺激库相关活性的方法、通过抑制内源海藻糖水平来抑制细胞或组织生长的方法、通过抑制内源海藻糖水平而防止冷冻甜化的方法、通过抑制内源海藻糖水平来抑制收获后甜菜中转化酶的方法、通过抑制内源海藻糖水平诱导抽苔的方法和通过抑制内源海藻糖水平增加植物产量的方法。可以设想对内源海藻糖水平的抑制效应是由细胞内海藻糖-6-磷酸水平的增加引起。因此，本专利技术也提供通过抑制内源海藻糖水平来增加细胞内海藻糖-6-磷酸有效来源的方法。对内源海藻糖水平的抑制是在海藻糖酶抑制剂存在的情况下培养或生长所述细胞、组织、器官或植物的结果。该抑制剂可以是以适于所述细胞、组织、器官或植株吸收的形式的有效霉素A，优选地其中水溶液中有效霉素A浓度为100nM到10mM，更优选地0.1到1mM。另一选择是使用以适于所述细胞、组织、器官或植株吸收的形式的86kD美洲大蠊(periplaneta americana)蛋白作为内源海藻糖水平的抑制剂。提供带有海藻糖抑制剂遗传信息的细胞、组织、器官或植株也是本专利技术的一部分。这可通过用编码美洲大蠊(periplaneta americana)86kD蛋白的基因转化来实现。选择性地，用能表达与编码内源海藻糖酶的基因所产生的RNA至少部分互补的RNA的DNA序列转化或者用编码海藻糖酶的DNA序列转化，该序列与编码内源海藻糖酶的DNA序列一致。具体地，编码内源海藻糖酶的DNA序列选自包括编码SEQ ID NO4蛋白的核苷酸序列、编码SEQ ID NO6蛋白的核苷酸序列、编码SEQ ID NO8蛋白的核苷酸序列和编码SEQ ID NO10蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列组，更具体地，编码内源海藻糖酶的DNA序列选自包括SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO5中所示的核苷酸序列、SEQ ID NO7中所示的核苷酸序列和SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列的核苷酸序列组。定义- 己糖激酶活性是存在于催化己糖转化为己糖-6-磷酸的反应的细胞中的酶活性。己糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖或任何其它C6糖。已认识到存在多种同功酶，它们都可能在所述生化反应中起部分作用。由于催化此反应，己糖激酶成为己糖(葡萄糖)信号转导中的关键酶。- 己糖信号是细胞感受己糖(葡萄糖)有效来源的调节机制。- 糖酵解是将葡萄糖转化成丙酮酸并同时产生ATP的反应系列。- 源物质的贮存为一个这样的过程，其中原始产物葡萄糖代谢成适于在细胞或特定组织中贮存的分子形式。这些形式可以为歧化形式(divers)。在植物界中贮存最可能以碳水化合物和多聚碳水化合物形式发生如淀粉、果聚糖和纤维素，或者作为更简单的单糖或双糖如果糖、蔗糖和麦芽糖；以油的形式如花生油或油酸油以及以蛋白形式如cruciferin、napin和油籽油菜种子中的贮存蛋白。在动物细胞中也形成多聚碳水化合物如糖元形成，并且将大量富含能量的碳化合物转化为脂肪和脂类。- 生物量为生物物质的总量。附图描述附图说明图1.带有新霉素-磷酸转移酶基因(NPTII)作为选择性标记的质粒pVDH275的图示，NPTII侧翼为35S花椰菜花叶病毒启动子(P35S)和终止子(T35S)；包含豌豆质体蓝素启动子(pPCpea)和胭脂氨酸合酶终止子(Tnos)的表达元件盒；右端(RB)和左端(LB)T-DNA边界序列和细菌卡拿霉素抗性(KanR)标记基因。图2.在pMOG1027(35S as-海藻糖酶)转基因马铃薯植株块茎中海藻糖的积累。图3.22株独立野生型马铃薯(S.tuberosum)克隆的块茎产量。图4.与野生型马铃薯株系相比，pMOG1027(35S as-海藻糖酶)和pMOG1027(845-11/22/28)(35S as-海藻糖酶pat TPS)转基因马铃薯株系的块茎产量。图5.与野生型马铃薯株系相比，pMOG1027(35S as-海藻糖酶)和pM本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过抑制内源海藻糖酶水平来修饰体内细胞、组织或器官的发育和／组成的方法。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：OJM格迪津，J佩恩，JCM斯米肯斯，MT斯米茨，
申请(专利权)人：辛根塔默根有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]