经修饰的甘氨酸氧化酶制造技术

本发明专利技术提供了可用于测量甘氨酸浓度的手段和方法。具体地，本发明专利技术提供了经修饰的酶，其中至少一种氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶特性(例如甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性、甘氨酸氧化酶的热稳定性、和甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性)；以及用于分析甘氨酸的方法，其包括使用经修饰的酶测量测试样品中含有的甘氨酸；等等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及经修饰的甘氨酸氧化酶、使用该经修饰的甘氨酸氧化酶分析甘氨酸的方法等。专利技术背景已知氨基酸作为活体中的组成是非常重要的，并且一些氨基酸可以变为健康状况的指示物。例如，提示了血浆中的甘氨酸浓度与肥胖症有关(非专利文献1)。甘氨酸是各种食物中天然含有的，并且用作食物添加剂。因此，氨基酸(特别是甘氨酸)的测量在一大批领域(诸如生物学调查、健康营养、医学治疗和食物制造)中具有重要的意义。使用诸如氨基酸分析仪、高效液相层析(HPLC)或LC-MS等仪器的方法广泛用作分析包括甘氨酸在内的氨基酸的方法。然而，这些仪器是大型且昂贵的，并且需要维护和操作仪器的技术知识和熟练程度，如此其引入、维护和利用需要高成本。还有，由于原则上有必要序贯分析每份样本，分析多份样本花费较长的时间。为了解决这些问题，已经开发出使用催化特定氨基酸的特异性反应的酶来分析氨基酸的方法，并且用于测量一些氨基酸的其试剂盒已经是商品化的。还已经实现了利用酶在电化学或光学上测量特定氨基酸的生物传感器(例如专利文献1，非专利文献2至4)。已知甘氨酸氧化酶是对甘氨酸起作用的酶(例如非专利文献5)。现有技术参考文献专利文献专利文献1：国际公开文本WO2005/075970非专利文献非专利文献1：P.Felig,E.Marliss,G.F.CahillJr.(1969)N.Engl.J.Med.281,811-816.非专利文献2：A.Guerrieri,T.R.I.Cataldi,R.Ciriello.(2007)Sens.ActuatorsBChem.126,424-430.非专利文献3：H.Olschewski,A.Erlenkotter,C.Zaborosch,G.-C.Chemnitius.(2000)EnzymeMicrob.Technol.26,537-543.非专利文献4：H.Endo,Y.Hayashi,Y.Kitani,H.Ren,T.Hayashi,Y.Nagashima.(2008)Anal.Bioanal.Chem.391,1255-1261.非专利文献5：L.Caldinelli,M.Pedotti,L.Motteran,G.Molla,L.Pollegioni(2009)Biochimie91,1499-1508.非专利文献6：S.E.Carpenter,D.J.Merkler(2003)Anal.Biochem.323,242-246.
技术实现思路
本专利技术要解决的问题在使用酶的前述氨基酸测量中，期望的是与氨基酸测量有关的酶的特性(例如酶的活性、稳定性和底物特异性)是卓越的。特别对于活性，在要在样本中检测的对象(诸如血液中的氨基酸)的浓度较低时，在底物浓度较低的条件下需要高活性。甘氨酸氧化酶的利用对于分析含有甘氨酸的样本是有希望的，但是它已经是有问题的，即迄今为止已经知道其性质的甘氨酸氧化酶在活性和稳定性上较低(例如非专利文献6)。还有，尚未对许多类型的氨基酸调查底物特异性。如上文描述，不可获得能够实际进行甘氨酸测量的酶。如此，尚未实现使用酶的测量甘氨酸的实际方法或用于测量甘氨酸的试剂盒和生物传感器。用于解决问题的手段作为一项广泛的研究，本专利技术人已经想到仅必须通过使用具有与甘氨酸测量有关的改善的特性的酶测量甘氨酸浓度，成功开发出具有此类改善的特性的甘氨酸氧化酶，并且如此完成本专利技术。因而，本专利技术如下：[1].一种经修饰的酶，其中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的一种或多种特性，其中所述一种或多种特性选自下组：(a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；(b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和(c)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。[2].[1]的经修饰的酶，其中所述突变是所述甘氨酸氧化酶的氨基酸序列中的一种或多种选自下组的取代：(a)TTS基序中的第一苏氨酸的取代，(b)TTS基序中的丝氨酸的取代，(c)HCY基序中的半胱氨酸的取代，(d)LRP基序中的亮氨酸的取代，(e)GML基序中的甲硫氨酸的取代，(f)SG基序中的丝氨酸的取代，和(g)PGT基序中的甘氨酸的取代。[3].[2]的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的第一苏氨酸被取代为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。[4].[2]或[3]的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的丝氨酸被取代为赖氨酸。[5].[2]-[4]中任一项的经修饰的酶，其中所述HCY基序中的半胱氨酸被取代为丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸、或丝氨酸。[6].[2]-[5]中任一项的经修饰的酶，其中所述LRP基序中的亮氨酸被取代为异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或脯氨酸。[7].[2]-[6]中任一项的经修饰的酶，其中所述GML基序中的甲硫氨酸被取代为异亮氨酸。[8].[2-7中任一项的经修饰的酶，其中所述SG基序中的丝氨酸被取代为精氨酸。[9].[2]-[8]中任一项的经修饰的酶，其中所述PGT基序中的甘氨酸被取代为酪氨酸或谷氨酰胺。[10].[1]-[9]中任一项的经修饰的酶，其中所述甘氨酸氧化酶源自芽孢杆菌属(Bacillus)。[11].[1]-[10]中任一项的经修饰的酶，其是下述(1)或(2)的蛋白质：(1)蛋白质，其包含在SEQIDNO:2的氨基酸中具有选自下组的一个或多个氨基酸残基的一个或多个取代的氨基酸序列：TTS基序中的第一苏氨酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸和PGT基序中的甘氨酸，所述一个或多个氨基酸残基取代为下述(i)-(vii)的一个或多个氨基酸残基：(i)对于TTS基序中的第一苏氨酸的取代的丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、或甘氨酸；(ii)对于TTS基序中的丝氨酸的取代的赖氨酸；(iii)对于HCY基序中的半胱氨酸的取代的丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸或丝氨酸；(iv)对于LRP基序中的亮氨酸的取代的异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或脯氨酸；(v)对于GML基序中的甲硫氨酸的取代的异亮氨酸；(vi)对于SG基序中的丝氨酸的取代的精氨酸；和(vii)对于PGT基序中的甘氨酸的取代的酪氨酸或谷氨酰胺；或(2)蛋白质，其包含在SEQIDNO:2的氨基酸序列中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经修饰的酶，其中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量有关的甘氨酸氧化酶的一种或多种特性，其中所述一种或多种特性选自下组：(a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；(b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和(c)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.29 JP 2013-0739061.一种经修饰的酶，其中至少一个氨基酸残基突变以改善与甘氨酸测量
有关的甘氨酸氧化酶的一种或多种特性，其中所述一种或多种特性选自下
组：
(a)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的活性；
(b)所述甘氨酸氧化酶的热稳定性；和
(c)所述甘氨酸氧化酶对甘氨酸的底物特异性。
2.根据权利要求1的经修饰的酶，其中所述突变是所述甘氨酸氧化酶的
氨基酸序列中的一种或多种选自下组的取代：(a)TTS基序中的第一苏氨酸
的取代，(b)TTS基序中的丝氨酸的取代，(c)HCY基序中的半胱氨酸的取代，
(d)LRP基序中的亮氨酸的取代，(e)GML基序中的甲硫氨酸的取代，(f)SG
基序中的丝氨酸的取代，和(g)PGT基序中的甘氨酸的取代。
3.根据权利要求2的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的第一苏氨酸
被取代为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。
4.根据权利要求2或3的经修饰的酶，其中所述TTS基序中的丝氨酸
被取代为赖氨酸。
5.根据权利要求2-4中任一项的经修饰的酶，其中所述HCY基序中的
半胱氨酸被取代为丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、
酪氨酸、或丝氨酸。
6.根据权利要求2-5中任一项的经修饰的酶，其中所述LRP基序中的
亮氨酸被取代为异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或脯氨酸。
7.根据权利要求2-6中任一项的经修饰的酶，其中所述GML基序中的
甲硫氨酸被取代为异亮氨酸。
8.根据权利要求2-7中任一项的经修饰的酶，其中所述SG基序中的丝
氨酸被取代为精氨酸。
9.根据权利要求2-8中任一项的经修饰的酶，其中所述PGT基序中的
甘氨酸被取代为酪氨酸或谷氨酰胺。
10.根据权利要求1-9中任一项的经修饰的酶，其中所述甘氨酸氧化酶
源自芽孢杆菌属(Bacillus)。
11.根据权利要求1-10中任一项的经修饰的酶，其是下述(1)或(2)的蛋

\t白质：
(1)蛋白质，其包含在SEQIDNO:2的氨基酸中具有选自下组的一个或
多个氨基酸残基的一个或多个取代的氨基酸序列：TTS基序中的第一苏氨
酸、TTS基序中的丝氨酸、HCY基序中的半胱氨酸、LRP基序中的亮氨酸、
GML基序中的甲硫氨酸、SG基序中的丝氨酸和PGT基序中的甘氨酸，所
述一个或多个氨基酸残基取代为下述(i)-(vii)的一个或多个氨基酸残基：
(i)对于TTS基序中的第一苏氨酸的取代丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、
或甘氨酸；
(ii)对于TTS基序中的丝氨酸的取代的赖氨酸；
(iii)对于HCY基序中的半胱氨酸的取代的丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、
组氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸或丝氨酸；
(iv...

【专利技术属性】
技术研发人员：小玉优哉，星野亘，高桥一敏，伊藤萌美，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP