抗真菌蛋白及其编码DNA和掺入此DNA的宿主制造技术

一种分离的蛋白或其部分或其突变蛋白，具有抗真菌活性，优选地抗卵菌纲活性，更优选地抗疫霉和／或抗腐霉活性，并且该蛋白质可从植物来源获得，由如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４所示的核苷酸序列编码。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及可以作为抗真菌蛋白的新型氧化酶及其编码DNA和掺入此DNA的宿主，以及通过使所述真菌病原体与所述蛋白接触以抵抗真菌病原体的方法。本专利技术进一步涉及掺入和表达编码抗真菌蛋白的DNA的植物和因此表现对真菌病原体易感性降低的植物。
技术介绍
在整个农作物栽培历史中，农作物植株的真菌疾病是农作物损失的主要因素之一。农作物的单种栽培促进了真菌病原体强毒种类的增殖并且新的各种植物变得在急剧增加的侵袭植物的进化病原体强毒株大范围危险中生长。由于携带病原体植物材料的国际运输，使疾病的发生明显恶化，使没有机会产生对病原体抗性的植物与病原体接触。因此由于人为的干预，宿主和病原体之间的天然平衡遭到破坏，在许多情况下带来灾难性的影响。这样的情况导致了诸如19世纪期间出现在爱尔兰的由马铃薯晚疫病真菌(致病疫霉)引起的灾难性损失甚至饥荒。真菌病也可能使一些农作物在大面积范围内完全不能生长，如萎焉镰孢毁灭生长在美国东部的大面积番茄时或霜霉病(葡萄生单轴霉)真菌摧毁生长在欧洲部分区域的藤本植物时就是这种情况。真菌疾病的爆发也可能如荷兰榆树疾病(Ceratocystis ulmi)破坏整个英国榆树(Ulmus procera)种群时发生的那样对环境有严重的影响。除了在农作物生长期间导致的损失，真菌疾病可能产生进一步的收获后损失。例如，各种软腐病如灰葡萄孢尤其在软水果中存在问题。真菌黄曲霉尽管不是真的引起疾病的真菌，但尤其在热带国家导致储藏花生和玉米收获后的腐病，并且是最严重的，因为它产生对人类非常有毒的毒素-黄曲霉毒素。与真菌病相关的主要经济问题存在于世界上更湿润的部分，主要是欧洲西部和湿热带。各种农作物管理技术如轮作和避免机械上土壤传播等可用于防止真菌病严重侵染的形成和传播。植物育种已在增加许多农作物对重要疾病抗性方面取得显著效果。例如，农作物育种者成功地将有效抵抗番茄尖镰孢的抗性基因1和1-2导入番茄。然而，特别是当种特异抗性由于快速进化的病原体新种类而减弱时，问题仍然存在。在番茄中，尖镰孢的另一个强毒株已经出现并且育种者正在寻求第三个有用的抗性基因。最近在生长在西部欧洲部分的谷类中黄锈病(条形柄锈菌)强毒株的爆发导致对具有对其它真菌抗性的品种使用的杀真菌剂快速增加。在这些特定情况下，如对育种者来说没有天然来源的抗性可用的情况下，化学品广泛地用于控制真菌病。在世界的许多地方化学杀真菌剂仍然是农作物生产成本中的主要投入。据统计1990年21％的农业化学品销售是用于杀真菌剂(5、54亿美元)。农场主和种植者有强烈的降低它们投入成本的愿望。与经济原因相提并论的是逐渐增强的环境因素。在更先进的经济中，尤其是在北美和西欧，来自政治家和消费者的关于较少依靠化学品投入的农业的压力逐渐增加。对于这样的要求的理由可能缺乏公认的原理或科学的证据，但是对一些关于残留在饮用水中或检测到的杀虫剂的量超过了食品残留物所能接受的最小量的报道的恐惧正在增加。例如在荷兰，有在2000年前将杀虫剂的总用量降低50％的强制要求。致病疫霉属于称为卵菌纲的真菌类。致病疫霉感染茄科的各个成员如马铃薯、番茄和一些观赏植物。它引起马铃薯和番茄的晚疫病并影响除了根部以外的所有部分。此真菌在地理上广泛分布并可以在所有生产马铃薯的国家中发现。马铃薯的晚疫病在经济上非常重要的，因为在节令的早期侵染会严重降低农作物产量。目前通过定期喷洒化学杀真菌剂(二硫代氨基甲酸盐类如代森锰锌、代森锰和代森锌)控制病害。从环境和经济的观点考虑，对由致病疫霉引起的病害的生物学控制比使用化学杀真菌剂更有利。腐霉也属于称为卵菌纲的真菌类。腐霉属不同于相关的疫霉属，因为形成相对不分化的孢子囊。此真菌在地理上广泛分布于所有陆地。由腐霉属种类引起的第一种主要病害类型是由于对大田或苗圃中幼苗侵袭的突然和快速的发展而导致的枯萎。腐霉属种类引起第二种类型的病害即根坏死并导致植物生长总体减慢(例如小麦和玉米)和产量损失。在欧洲由腐霉引起的主要损失是针对大田农作物如甜菜。损失基本上趋向于全或无。相似地，苗圃种植的观赏植物和森林树木也可能遭到完全破坏。(有关卵菌纲的综述，参见欧洲植物病害手册，由I.M.Smith等编辑，1988,Blackwell Scientific Publications，第8章)。另一种真菌是葡萄孢，尤其灰葡萄孢，属于半知菌类，它导致灰霉疫病或芽和花的疫病，它普遍存在于收获后的软熟水果上，但它也可能在收获前出现。它也可以影响各种蔬菜如莴苣、豆类和番茄。葡萄孢的其它种类普遍存在于花卉如百合、唐菖蒲和郁金香上。从TMV诱导的烟草叶中分离的具有抗真菌活性的蛋白公开于WO91/18984，该蛋白能引起致病疫霉的发芽孢子和菌丝尖裂解并使菌丝体以降低的速率生长。该蛋白具有约24千道尔顿的表观分子量并命名为AP24。将由AP24基因的核酸序列推测的其完整氨基酸序列与数据库中的已知蛋白比较，揭示了此蛋白是渗透蛋白样蛋白。尽管在抵抗真菌病原体如致病疫霉方面已取得初步成功，但是仍然需要鉴定能够合成具有抗此真菌病原体活性的抗真菌蛋白的遗传工程植株并分离具有抵抗此真菌的抗真菌活性的其它蛋白。专利技术概述本专利技术提供可从植物来源获得的具有针对卵菌纲优选地针对疫霉和/或腐霉的最有效的抗真菌活性并通过SDS(十二烷基磺酸钠)-PAGE(聚丙烯酰凝胶)电泳测定分子量为约55-65千道尔顿的分离的蛋白。优选的蛋白是那些可从向日葵或莴苣植株获得的蛋白。甚至更优选的蛋白是可从用水杨酸钠诱导的向日葵或莴苣叶子获得的蛋白。更优选的分离蛋白的特征在于选自含有选自SEQ ID NO:1,2或6,16,20,49,50,51,58,71,73或75中所示的氨基酸序列并具有抗真菌活性，特别是抗疫霉和/或抗腐霉活性的蛋白的群体及其突变蛋白。根据本专利技术所述的进一步优选的蛋白的特征在于它包括含有由SEQ ID NO:16,20,58,71,73或75代表的氨基酸序列或诸如由SEQ ID NO:6代表的部分序列的蛋白。本专利技术也提供新型酶，其酶活性是碳水化合物的氧化。本专利技术也包括包含能编码根据本专利技术所述的蛋白的开放阅读框架的分离DNA序列以及能在严格条件下与其杂交的DNA，优选地特征在于该开放阅读框架能编码根据本专利技术所述的蛋白。本专利技术也提供根据本专利技术所述的嵌合DNA序列，进一步包含转录起始区域和选择性地转录终止区域，它们与所述的开放阅读框架连接使嵌合DNA在存在于存活宿主细胞中时能在宿主细胞中转录，从而产生含所述开放阅读框架的RNA。根据本专利技术所述的优选的嵌合DNA序列是其包含开放阅读框架的RNA能在存在于所述宿主细胞中时在宿主细胞中翻译为蛋白从而合成所述蛋白的嵌合DNA序列。尤其优选的是包含如SEQ ID NO:15,19,57,70,72或74所示序列的DNA序列。本专利技术也包括包含根据本专利技术所述的DNA序列的嵌合DNA序列，它可以选自复制子如细菌克隆质粒和载体如细菌表达载体、(非整合型)植物病毒载体、农杆菌Ti质粒载体如双元载体等；以及包含根据本专利技术所述的复制子或载体并且一旦所述复制子存在其中时能维持该复制子的宿主细胞。根据实施方案优选的宿主细胞是植物细胞，所述的载体是非整合型病毒载体。本专利技术进一步提供根据本专利技术所述的嵌合DNA序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：M·H·斯图威，J·H·H·V·库斯特斯，M·B·斯拉布拉格，L·S·美彻斯，J·P·E·范德威特特路斯特，W·拉格威格，A·S·普斯坦，
申请(专利权)人：辛根塔默根有限公司，
类型：发明
国别省市：