以少量精细胞对哺乳动物进行有性别选择的授精制造技术

以商业上可实施的方式并用以前认为在商业上不可能实现的精子剂量进行人工授精，繁殖性别选择的哺乳动物后代。改进的授精系统特别采用了精子性别选择的分类，还实现超数排卵、产生多个胚胎以得到选择性别的胚胎。该系统结合了其它技术，包括改进外鞘液的技术、其它使精细胞压力最小化的方案。用于牛的２．９％的柠檬酸钠外鞘液和用于马的ＨＥＰＥＳ牛配子培养基。描述了改进的精子收集系统和收集技术，使精子样品及其所繁殖的动物目前已实现了在商业上的应用。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及哺乳动物后代的性别选择。特别涉及低剂量人工授精和为繁殖所需性别的动物后代而增加产卵的方面。特别是本专利技术涉及无论使用何种分类技术，用低剂量实现性别选择的人工授精、涉及为性别选择经流式细胞计数术分类精子和低剂量人工授精系统，以及增加排卵结果的技术等。长期以来，人们一直希望能够选择动物后代的性别。除了明显的心理因素，当考虑到诸如牛的食用动物以及战利品动物，如马等类似动物时，实际的哺乳动物后代性别选择具有明显的经济学价值。由于存在这种巨大的需求，为获得性别选定的后代人们进行了各种大量的努力。似乎最可能实现所需结果的工作集中在授精前分类和选择X和Y精子。尝试分类X和Y精子所面临的一个挑战是精子的数量很大。在自然授精中，有些动物种类产生数十亿的精子；在人工授精中虽然使用精子较少些，但仍然需很大数目。例如，人工授精技术通常使用1千万至5亿个精子(取决于物种)。因此即使在人工授精环境中也需要极大数目的精子。已尝试了许多方法来实现分离携带X-和Y-染色体的精子。这些方法包括诸如在美国专利号4276139中公开的磁性分离技术，在美国专利号5514537中公开的柱式(columnar)分离技术，在美国专利号3894529，再审专利号32350，美国专利号4092229，4067965和4155831中讨论的重量分析技术。在US4083957中公开了对电学特性进行分析的尝试，在美国专利号4225405，4698142和4749458中讨论了结合电学和重力特性的分析。在美国专利号4009260和4339434中显示了尝试分析精子活力。诸如在美国专利号4511661和4999283(涉及单克隆抗体)和美国专利号5021244，5346990，5439362和5660997(涉及膜蛋白)，和美国专利号3687803，4191749，4448767，和4680258(涉及抗体)中显示的化学技术，以及在美国专利号4085205中显示的添加血清成分。尽管似乎提供了具有较高效力的各种技术，但事实上目前没有一种技术达到性别预选所需的水平。然而，不论最终使用何种分离技术，自然存在的大量精子的竞争性结合和分离携带X-和Y-染色体的精子的研究使开发以少量精子实现授精成为可能。目前，用于实现分离携带X-和Y-染色体的精子的定量技术包括通过流式细胞计数术逐个辨别和分离精子。该技术随着技术进步和发现携带X-和Y-染色体的精子对不同的染色剂吸收显示出其可能性。这一点以前在美国专利号4362246中进行了讨论且通过Lawrence Johnson在美国专利号4135759中公开的技术进行了重要的阐述。Johnson的这种利用流式细胞计数术分离携带X-和Y-染色体的精子的技术非常重要和先进，因为它首次使分离该精细胞在商业上成为可能。尽管仍然是实验性的，但通过高速流式细胞计数器，如Cytomation公司生产的MoFlo流式细胞计数器已显著增强了这种分离的效果且已在包括美国专利号5150313，5602039，5602349和5643796以及国际PCT专利申请WO96/12171的各种其它专利中进行了讨论。尽管利用Cytomation公司生产的MoFlo细胞计数器极大地增加了速率，且尽管这种速率增加与常用的高数量的精细胞特别相关，但仍然存在一些问题。用MoFlo流式细胞计数器尽管几乎可使速率增加10倍，但许多情况下需要越来越短的分类时间。首先，已发现作为实际问题，精子是时间关键性细胞。如果它们较长时间未用将失去效力。其次，收集、分类和授精的计时使速度在商业上有高度的重要性。因此，精细胞和该方法对时间要求的特性使速度成为实现高效率和成功率的至关重要因素。从实践上到理论上还存在其它的问题。在实践方面，需要使用廉价的可大量使用的物质获得性别分类的精子样品。在费用方面，还需要能以尽可能有效的劳动实现分类(以及收集和授精)。因此，为了该领域成功商业生产，可能仅提高效率的改进仍然是有意义的。关于实际费用，是整个方法实践中最为棘手和敏感的方面。为此，需要简化过程使其程序尽可能粗略，以便操作错误或技巧的影响不大。结合这些情况更加需要用较小量的精子进行授精。除了该方法的精密性外，已知精子本身是极其脆弱的细胞。尽管初看起来认为容易理解，但事实上该细胞的敏感性还没有被充分认识。一般在流式细胞计数术进行中，大多数分类的细胞或颗粒通常呈球形而且能经受各种物理方法处理。但精细胞却不是这样。事实上，正如本专利技术所公开的，采用通常的流式细胞计数术的方法对于在某些应用中进行精细胞的细胞计数术分类是不可行的。细胞的稀释、流式细胞计数仪需要逐个分离和鉴别细胞以及典型的流式细胞计数术在本身施加于被分类的细胞或其它物质的压力均可改变其敏感性。这也说明精细胞的特性，因为看起来即使精细胞通过流式细胞计数器并被分类时没有肉眼可辨别的副作用，但事实上这些细胞本身已经接受了压力，使它们在授精过程中没有达到最佳状况。因此，这些因素的相互作用对于精细胞分类并最终用于人工授精产生了一些特有的问题。尽管Johnson的专利和有关技术取得了巨大的进展，但仍然存在另一问题，即用性别选择的精子实现低剂量授精非常困难，无论使用何种分离技术。尽管有人曾经进行过低剂量授精，但似乎更多的是在理论上或实验室中而不是用于实践中或商业应用中。据此，不仅需要实现低剂量授精，同时要达到与目前不选择性别的，高剂量人工授精同样的受孕成功率。因此，本专利技术人在性别选择和低剂量人工授精两方面所取得的进展首次使商业应用成为可能。同样，尽管Johnson的专利和有关技术取得了巨大的进展，但仍然面临另一问题，即高成功率的人工授精受众多因素相互影响，具有统计学特性。因此，建议的解决办法在某种程度上可能涉及结合一些因素，在非常精确的统计学研究中显示出某因素单独存在或者与其它因素结合是必须的。这一决定进一步结合如下事实，即，该结果本身可随物种而改变且由于在起初不可能有足够多的数据进行试验和统计学取样的事实而难以确定。由于这些原因，本专利技术还涉及结合多种因素，这些单独或结合的因素对特定的应用提供了合适的解决方法。因此认为本说明书是非常广义的，可实现所公开的技术的各种组合和渗透。可能存在与其它因素的未知协同效应。这些因素可包括在分类中，或者存在于流式细胞计数器内，或在收集步骤及授精步骤中所涉及。目前，研究主要在牛类中进行，然而，并不认为这些技术将局限于这类物种，因为这项技术只与精细胞相关。除了精细胞外，该技术可应用于其它敏感细胞的分类或在细胞进行分类时使流式细胞计数术造成的压力的影响减到最小。令人感兴趣的是，当本专利技术采用的方法使分类的影响或对精细胞的压力最小化时，其他人实际上通过增加压力和对速度的需要及其它这种操作似乎采用的步骤偏离了这一方向。实质上，低剂量授精和高速处理的方式可能以单独或者互相联系的方式造成互相限制的问题。因此，尽管对高速度、低剂量选择性别的授精早有需要，而且认为技术不令人满意，且尽管实现的技术和环境早已可获得，但在本专利技术前这些技术的一些进展或者其组合被本领域的技术人员明显的忽略了。也许在某种程度上他们没有意识到这个问题涉及到多因素相互作用以及本领域涉及的细胞类型(精细胞或者也许是物种特异性精细胞)特有的必要性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种繁殖具有预定的性别的哺乳动物的方法，包括： ａ．收集一种雄性哺乳动物的精子细胞； ｂ．测定多个所述精子的性别； ｃ．根据所测定的性别分类所述的精子细胞； ｄ．制备一种人工授精样品，该样品中的精子数量相对低于进行典型的人工授精时的用量； ｅ．将至少一部分所述的人工授精样品注入所述种类的雌性哺乳动物体内； ｆ．使所述种类的雌性哺乳动物体内至少一个卵受精，其成功率与用典型的未进行性别选择的精子剂量进行人工授精在统计学上相当； ｇ．繁殖所需性别的子代哺乳动物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：乔治E赛德，丽莎赫里克夫，约翰申克，
申请(专利权)人：XY公司，科罗拉多州州立大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]