以少量精细胞对哺乳动物进行有性别选择的授精制造技术

本发明专利技术提供一种以少量精细胞对哺乳动物进行有性别选择的授精技术，特别是以商业上可实施的方式并用以前认为在商业上不可能实现的精子剂量进行人工授精，繁殖性别选择的哺乳动物后代。本发明专利技术通过采用精子性别选择的分类技术，还实现了超数排卵、产生多个胚胎以得到选择性别的胚胎。本发明专利技术的授精技术结合了包括改进外鞘液的技术和其它使精细胞压力最小化的技术，改进了精子收集系统和收集技术，实现了精子样品及其所繁殖的动物在商业上的应用。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及哺乳动物后代的性别选择。特别涉及低剂量人工授精和 为繁殖所需性别的动物后代而增加产卵的方面。特别是本专利技术涉及无论 使用何种分类技术，用低剂量实现性别选择的人工授精、涉及为性别选 择经流式细胞计数术分类精子和低剂量人工授精系统，以及增加排卵结 果的技术等。
技术介绍
长期以来，人们一直希望能够选择动物后代的性别。除了明显的心 理因素，当考虑到诸如牛的食用动物以及战利品动物，如马等类似动物 时，实际的哺乳动物后代性别选择具有明显的经济学价值。由于存在这 种巨大的需求，为获得性别选定的后代人们进行了各种大量的努力。似 乎最可能实现所需结果的工作集中在授精前分类和选择X和Y精子。尝试分类X和Y精子所面临的一个挑战是精子的数量很大。在自然 授精中，有些动物种类产生数十亿的精子；在人工授精中虽然使用精子较 少些，但仍然需很大数目。例如，人工授精技术通常使用1千万至5亿个 精子(取决于物种)。因此即使在人工授精环境中也需要极大数目的精子。已尝试了许多方法来实现分离携带X-和Y-染色体的精子。这些方法 包括诸如在美国专利号4276139中公开的磁性分离技术，在美国专利号 5514537中公开的柱式(columnar)分离技术，在美国专利号3894529，再 审专利号32350，美国专利号4092229， 4067965和4155831中讨论的重量分析技术。在US4083957中公开了对电学特性进行分析的尝试，在美 国专利号4225405， 4698142和4749458中讨论了结合电学和重力特性的 分析。在美国专利号4009260和4339434中显示了尝试分析精子活力。 诸如在美国专利号4511661和4999283 (涉及单克隆抗体)和美国专利号 5021244， 5346990， 5439362和5660997 (涉及膜蛋白)，和美国专利号 3687803， 4191749， 4448767，和4680258 (涉及抗体)中显示的化学技 术，以及在美国专利号4085205中显示的添加血清成分。尽管似乎提供 了具有较高效力的各种技术，但事实上目前没有一种技术达到性别预选 所需的水平。然而，不论最终使用何种分离技术，自然存在的大量精子 的竞争性结合和分离携带X—和Y—染色体的精子的研究使开发以少量 精子实现授精成为可能。目前，用于实现分离携带X—和Y—染色体的精子的定量技术包括 通过流式细胞计数术逐个辨别和分离精子。该技术随着技术进步和发现 携带X—和Y—染色体的精子对不同的染色剂吸收显示出其可能性。这 一点以前在美国专利号4362246中进行了讨论且通过Lawrence Johnson 在美国专利号4135759中公开的技术进行了重要的阐述。Johnson的这种 利用流式细胞计数术分离携带X—和Y—染色体的精子的技术非常重要 和先进，因为它首次使分离该精细胞在商业上成为可能。尽管仍然是实 验性的，但通过高速流式细胞计数器，如Cytomation公司生产的MoFk^ 流式细胞计数器己显著增强了这种分离的效果且已在包括美国专利号 5150313， 5602039， 5602349和5643796以及国际PCT专利申请 W096/12171的各种其它专利中进行了讨论。尽管利用Cytomation公司 生产的MoFlc^细胞计数器极大地增加了速率，且尽管这种速率增加与常 用的高数量的精细胞特别相关，但仍然存在一些问题。用MoFk^流式细 胞计数器尽管几乎可使速率增加10倍，但许多情况下需要越来越短的分 类时间。首先，已发现作为实际问题，精子是时间关键性细胞。如果它 们较长时间未用将失去效力。其次，收集、分类和授精的计时使速度在 商业上有高度的重要性。因此，精细胞和该方法对时间要求的特性使速 度成为实现高效率和成功率的至关重要因素。从实践上到理论上还存在其它的问题。在实践方面，需要使用廉价 的可大量使用的物质获得性别分类的精子样品。在费用方面，还需要能 以尽可能有效的劳动实现分类(以及收集和授精)。因此，为了该领域成功 商业生产，可能仅提高效率的改进仍然是有意义的。关于实际费用，是 整个方法实践中最为棘手和敏感的方面。为此，需要简化过程使其程序 尽可能粗略，以便操作错误或技巧的影响不大。结合这些情况更加需要 用较小量的精子进行授精。除了该方法的精密性外，已知精子本身是极其脆弱的细胞。尽管初 看起来认为容易理解，但事实上该细胞的敏感性还没有被充分认识。一 般在流式细胞计数术进行中，大多数分类的细胞或颗粒通常呈球形而且 能经受各种物理方法处理。但精细胞却不是这样。事实上，正如本专利技术 所公开的，采用通常的流式细胞计数术的方法对于在某些应用中进行精 细胞的细胞计数术分类是不可行的。细胞的稀释、流式细胞计数仪需要 逐个分离和鉴别细胞以及典型的流式细胞计数术在本身施加于被分类的 细胞或其它物质的压力均可改变其敏感性。这也说明精细胞的特性，因 为看起来即使精细胞通过流式细胞计数器并被分类时没有肉眼可辨别的 副作用，但事实上这些细胞本身已经接受了压力，使它们在授精过程中 没有达到最佳状况。因此，这些因素的相互作用对于精细胞分类并最终 用于人工授精产生了一些特有的问题。尽管Johnson的专利和有关技术取得了巨大的进展，但仍然存在另 一问题，即用性别选择的精子实现低剂量授精非常困难，无论使用何种 分离技术。尽管有人曾经进行过低剂量授精，但似乎更多的是在理论上 或实验室中而不是用于实践中或商业应用中。据此，不仅需要实现低剂 量授精，同时要达到与目前不选择性别的，高剂量人工授精同样的受孕 成功率。因此，本专利技术人在性别选择和低剂量人工授精两方面所取得的 进展首次使商业应用成为可能。同样，尽管Johnson的专利和有关技术取得了巨大的进展，但仍然 面临另一问题，即高成功率的人工授精受众多因素相互影响，具有统计 学特性。因此，建议的解决办法在某种程度上可能涉及结合一些因素，中显示出某因素单独存在或者与其它因素结合 是必须的。这一决定进一步结合如下事实，即，该结果本身可随物种而 改变且由于在起初不可能有足够多的数据进行试验和统计学取样的事实 而难以确定。由于这些原因，本专利技术还涉及结合多种因素，这些单独或 结合的因素对特定的应用提供了合适的解决方法。因此认为本说明书是 非常广义的，可实现所公开的技术的各种组合和渗透。可能存在与其它 因素的未知协同效应。这些因素可包括在分类中，或者存在于流式细胞 计数器内，或在收集步骤及授精步骤中所涉及。目前，研究主要在牛类 中进行，然而，并不认为这些技术将局限于这类物种，因为这项技术只 与精细胞相关。除了精细胞外，该技术可应用于其它敏感细胞的分类或 在细胞进行分类时使流式细胞计数术造成的压力的影响减到最小。令人感兴趣的是，当本专利技术采用的方法使分类的影响或对精细胞的 压力最小化时，其他人实际上通过增加压力和对速度的需要及其它这种 操作似乎采用的步骤偏离了这一方向。实质上，低剂量授精和高速处理 的方式可能以单独或者互相联系的方式造成互相限制的问题。因此，尽 管对高速度、低剂量选择性别的授精早有需要，而且认为技术不令人满 意，且尽管实现的技术和环境早已可获得，但在本专利技术前这些技术的一 些进展或者其本文档来自技高网...

【技术保护点】
为分类所需的细胞改进的流式细胞计数仪系统，包括：　ａ．提供流式细胞计数仪分析细胞的一种细胞源；　ｂ．为所述细胞创造一种化学协调的外鞘液环境的外鞘液源，该外鞘液使分类前后的细胞的液体环境协调一致；　ｃ．一个喷嘴，进入所述外鞘 液环境的所述细胞可以通过其喷出；　ｄ．一个振荡器，当所述外鞘液通过所述喷嘴时作用于该外鞘液；　ｅ．一个能够对所述细胞起反应的细胞识别系统；　ｆ．一个可以分出所需特性细胞的分类区别系统；　ｇ．放置已分类的具有所需特性细 胞的收集器。

【技术特征摘要】
US 1997-12-31 09/001,394;US 1998-1-29 09/015,4541. 为分类所需的细胞改进的流式细胞计数仪系统，包括a. 提供流式细胞计数仪分析细胞的一种细胞源；b. 为所述细胞创造一种化学协调的外鞘液环境的外鞘液源，该外鞘液使分类前后的细胞的液体环境协调一致；c. 一个喷嘴，进入所述外鞘液环境的所述细胞可以通过其喷出；d. 一个振荡器，当所述外鞘液通过所述喷嘴时作用于该外鞘液；e. 一个能够对所述细胞起反应的细胞识别系统；f. 一个可以分出所需特性细胞的分类区别系统；g. 放置已分类的具有所需特性细胞的收集器。2. 权利要求1所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的分类前后的细胞的液体环境含有至少一种对细胞高敏感的化 学成分，其中所述的化学协调的外鞘液源可使所述高敏感化学成分的改 变最小化。3，权利要求2所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的高敏感的化学成分包括一种代谢的化学成分。4. 权利要求2所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的高敏感的化学成分包括一种柠檬酸盐。5. 权利要求1所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的细胞源创造所述的分类前细胞液体环境，其中所述的收集器 创造所述的分类后细胞液体环境。6. 权利要求2所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的细胞源包括非修复细胞。7. 权利要求6所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的细胞源包括有非转录DNA细胞。8. 权利要求6所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的细胞源包括有非复制DNA细胞。9. 权利要求6所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统，其中所述的细胞源包括有精子细胞。10. 权利要求2或4所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统，其中所述的细胞源包括牛精子细胞。11. 权利要求2所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的细胞源包括马精子细胞。12. 权利要求1所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的细胞源包括在外鞘液环境中对化学成分高敏感的细胞。13. 权利要求9所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的收集器用于供应低剂量的精子。14. 权利要求13所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的低剂量的精子包括少于10%的所述典型剂量。15. 权利要求13所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的精子细胞是牛精子细胞，其中所述的低剂量的精子包括 少于50万精子数的剂量。16. 权利要求13所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的精子细胞是牛精子细胞，其中所述的低剂量的精子包括 少于30万精子数的剂量。17. 权利要求13所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的精子细胞是马精子细胞，其中所述的低剂量的精子包括 少于1000万精子数的剂量。18. 权利要求4所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的化学协调的外鞘液源包括一种含2.9%柠檬酸钠的溶液。19. 权利要求18所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的细胞源包括牛精子细胞。20. 权利要求19所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的收集器用于提供人工授精用精子。21. 权利要求19所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的收集器用于提供低剂量的人工授精用精子。22. 权利要求4所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统，其中所述的化学协调的外鞘液包括一种含有hepes缓冲培养基的溶液。23. 权利要求22所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的细胞源包括马精子细胞。24. 权利要求23所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的收集器用于提供人工授精用精子。25. 权利要求24所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的收集器用于提供低剂量的人工授精用精子。26. 权利要求1、 2、 4、 9、 21或25所述的为分类所需细胞改进的 流式细胞计数仪系统，其中所述的喷嘴、振荡器、细胞识别系统和分类 区别系统是流式细胞计数仪系统的组件，其中所述流式细胞计数仪系统 包括一个高速细胞分类器。27. 权利要求26所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的高速细胞分类器以每秒至少500个的速度分类所述待分 析的细胞。28. 权利要求26所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系 统，其中所述的高速细胞分类器在每平方英寸至少50磅的压力下进行操 作。29. 权利要求9所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪系统， 其中所述的收集器包括一个具有缓冲因素的容器。30. 权利要求29所述的为分类所需细胞改进的流式细胞计数仪...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治E赛德，丽沙赫里克夫，约翰申克，
申请(专利权)人：XY公司，科罗拉多州州立大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]