一种快速检测乙肝环状DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测乙肝环状DNA的方法。本发明专利技术快测HBV cccDNA的方法，步骤如下：Ⅰ、采用HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA；Ⅱ、扩增和纯化HBV cccDNA；Ⅲ、快测；其中，HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备的法如下：(1)采用化学共沉淀的制备Fe3O4纳米粒子；(2)采用反相乳液的制备硅壳磁性纳米颗粒；(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。本发明专利技术的法可以有效快测HBV cccDNA，特异性和灵敏度高，临床应用前景良好。

A method for rapid detection of hepatitis B ring DNA

The present invention discloses a method for rapid detection of hepatitis B ring DNA. Step method, the invention cccDNA HBV rapid test are as follows: 1, using HBV cccDNA specific DNA molecular probe magnetic nanoparticle separation and enrichment of HBV cccDNA; II, amplification and purification of HBV cccDNA; III, fast measurement; the preparation method is as follows HBV cccDNA specific DNA molecular probe magnetic nanoparticles micro ball: (1) the Fe3O4 nanoparticles were prepared by chemical coprecipitation; (2) using silica coated magnetic nanoparticles were prepared by inverse emulsion; (3) avidin modification of silica coated magnetic nanoparticles; (4) ssDNA for cccDNA sequence specific probe coupling. The method can effectively detect HBV cccDNA fast, specificity and high sensitivity, good clinical application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测乙肝环状DNA的方法
本专利技术涉及一种富集分离和快速检测乙肝环状DNA的方法。
技术介绍
慢性乙型肝炎是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，目前尚无特效药能够治愈。而HBVcccDNA是乙肝病毒持续感染、难以治愈的关键因素，通过检测HBVcccDNA可以了解HBV感染状态及传染性，评价药物治疗HBV的疗效，帮助了解机体清除HBV的程度，为临床医生判断何时停止抗病毒治疗及停止治疗后HBV是否会重新复制活跃导致乙肝复发提供一个客观指标，也是评价肝外组织是否被HBV感染以及在肝移植中评价移植肝脏是否被再感染的指标。国内外学者已建立了许多检测HBVcccDNA的方法，如，Southern印迹杂交法、PCR法等等。但是这些方法的特异性和灵敏度均不理想。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高特异性和高灵敏度的检测HBVcccDNA的方法。本专利技术检测HBVcccDNA的方法，骤如下：I、采用HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBVcccDNA；II、扩增和纯化HBVcccDNA；III、检测；其中，HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备方法如下：(1)采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子；(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/LFeCl3溶液与2.0mol/LFeCl2溶液混合，FeCl3溶液与FeCl2溶液的体积比为4∶1，加入FeCl2溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl2溶液15倍体积的浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe3O4纳米粒子。所述步骤(2)的方法如下：将TritonX-100、正己醇和环己烷按体积比1∶1∶4混合均匀，加入Fe3O4纳米粒子，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。其中，加入Fe3O4纳米粒子溶液的浓度为5mmol/L，加入的量为TritonX-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的2/5；正硅酸乙酯和氨水的加入量分别为TritonX-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的20倍。所述步骤(3)的方法如下：将2.5mg/ml的链霉亲和素溶液加入到硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次，再加入2％的戊二醛溶液在室温下浸泡，得磁性纳米悬浊液。所述步骤(4)的方法如下：1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液，离心，弃上清，加入结合缓冲液，制成浓度为1μg/μl的磁性微粒悬液，其中，结合缓冲液是Tris-HCl和NaCl的混合溶液，Tris-HCl的浓度为20mmol/L，NaCl的浓度为150mmol/L；2)探针预处理：将探针配制成浓度为10μM的探针溶液；3)偶联：在步骤1)制得到的磁性微粒悬液中加入15μl步骤2)制得的探针溶液，在37℃、150rpm/min条件下反应2h；4)封闭、清洗，即可。所述步骤2)中的探针溶液包含4条探针，4条探针的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～4所示，4条探针的5’端均标记有生物素。所述步骤I中，分离富集cccDNA的方法是：取待检样品，加入权利要求7所述HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球，混匀，在外磁场环境中作用20min，去除上清液，通过分子变性解离，即可得到富集分离的cccDNA。所述步骤II中，扩增和纯化HBVcccDNA采用RCV技术扩增和纯化。所述步骤III中，所述检测采用电化学生物传感技术对HBVcccDNA进行检测。优选地，所述电化学生物传感技术对HBVcccDNA进行检测的步骤为：a、将电化学生物传感器在双蒸水中清洗两次，烘干1min；将液体池覆盖在电化学生物传感器表面后，一起放入电化学生物传感器反应池中；b、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入针对cccDNA特异序列的ssDNA探针50μL，然后将含有电化学生物传感器的反应池放入到充满氮气的电化学生物传感器孵育盒中孵育20min后，取出用无水乙醇轻轻清洗，并在氮气中烘干1min；针对cccDNA特异序列的ssDNA探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1～4所示；c、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入RCA扩增和纯化后HBVcccDNA混合液后放入电化学生物传感器孵育盒中。d、分别对应电化学生物传感器的16个反应单元中加入辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢(H2O2)、四甲基联苯安(TMB)混合液20μL。e、再通过差分脉冲电流图和电流时间曲线图分析数据，根据所检测不同浓度的HBVcccDNA绘制工作曲线。本专利技术主要利用磁性纳米分离技术的富集性、RCV技术的特异性以及电化学生物传感技术的灵敏性来创新建立HBVcccDNA检测新方法，有望有效提取和特异分离cccDNA，有望避免样本中cccDNA含量低而又被同源DNA干扰，有效提高HBVcccDNA检测的灵敏度和特异性。构建一种HBVcccDNA高灵敏电化学生物传感阵列检测新技术，为HBVcccDNA感染的检测和筛查提供一种新的途径，提高HBVcccDNA检测的敏感性和特异度。实验结果说明，本专利技术HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球可以有效特异捕获HBVcccDNA，能够实现HBVcccDNA的高效准确检测，检测方法的灵敏度高，特异性强，快速简便，应用前景良好。下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明，但是并不是对本专利技术的限制，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。附图说明图1磁性纳米微球分离法HBVcccDNA步骤原理图，A为Fe3O4纳米粒子，b为SiO2纳米粒子，c为Fe3O4纳米粒子@SiO2复合纳米粒子，d为亲和素，e为亲和素化的Fe3O4纳米粒子@SiO2复合纳米粒子，f为生物素化的cccDNA互补捕获DNA探针，g为Fe3O4@SiO2/亲和素-生物素/捕获DNA探针，h为细胞株中分离出的HBVcccDNA分子，i为培养稳定复制的HBV基因组的细胞株，j为Fe3O4@SiO2/亲和素-生物素/捕获DNA探针/HBVcccDNA，k为磁性分离装置。具体实施方式实验例1本专利技术检测HBVcccDNA的方法一、检测方法1、HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备制备工艺如图1所示：1.HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备1.1化学共沉淀法制备Fe3O4纳米粒子：将20mlFeCl3(1.0mol/L)与5mlFeCl2(2.0mol/L，在2.0mol/L的盐酸溶液中配制)溶液混合均匀加入到250ml0.7mol/L的氨水溶液中，离心分离后所得的黑褐色沉淀用150ml2.0mol/L的高氯酸溶液分散，用超纯水洗至中性，干燥，得到Fe3O4纳米粒子。1.2反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒：将TritonX-100、正己醇和环己烷按体积比1∶1∶4混合均匀，得混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测HBV cccDNA的方法，其特征在于：步骤如下：Ⅰ、采用HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA；Ⅱ、扩增和纯化HBV cccDNA；Ⅲ、检测；其中，HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备方法如下：(1)采用化学共沉淀的制备Fe3O4纳米粒子；(2)采用反相乳液的制备硅壳磁性纳米颗粒；(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。

【技术特征摘要】
1.一种检测HBVcccDNA的方法，其特征在于：步骤如下：Ⅰ、采用HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBVcccDNA；Ⅱ、扩增和纯化HBVcccDNA；Ⅲ、检测；其中，HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备方法如下：(1)采用化学共沉淀的制备Fe3O4纳米粒子；(2)采用反相乳液的制备硅壳磁性纳米颗粒；(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/LFeCl3溶液与2.0mol/LFeCl2溶液混合，FeCl3溶液与FeCl2溶液的体积比为4:1，加入FeCl2溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl2溶液15倍体积的浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe3O4纳米粒子。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)的方法如下：将TritonX-100、正己醇和环己烷按体积比1：1：4混合均匀，加入Fe3O4纳米粒子，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：加入Fe3O4纳米粒子溶液的浓度为5mmol/L，加入的量为TritonX-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的2/5；正硅酸乙酯和氨水的加入量分别为TritonX-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的20倍。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)的方法如下：将2.5mg/ml的链霉亲和素溶液加入到硅壳磁性纳米颗粒中，在4℃下恒温振荡培育24h，用PBS缓冲液洗涤颗粒3次，再加入2％的戊二醛溶液在室温下浸泡，得磁性纳米悬浊液。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)的方法如下：1)纳米预处理：取磁性纳米颗粒混悬液，离心，弃上清，加入结合缓冲液，制成浓度为1μg/μl的磁性微粒悬液，其中，结合缓冲液是Tris-HCl和NaC...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭永灿，涂植光，赵朝辉，王友强，
申请(专利权)人：西南医科大学附属中医医院，
类型：发明
国别省市：四川,51