出芽短梗霉菌及其发酵生产普鲁兰多糖的方法技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，具体涉及一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(

【技术实现步骤摘要】
出芽短梗霉菌及其发酵生产普鲁兰多糖的方法
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株。
技术介绍
普鲁兰多糖以其优良的成膜性、阻气性、水溶性、生物相容性及可降解等特性，受到食品、医药等行业的青睐，尤其是在农产品保鲜方面得到越来越多的关注。作为优良的食品添加剂和保鲜剂，因国外产品一直处于垄断地位，导致价格居高不下，售价一直在25美元/公斤上下。目前国内该产品生产水平较低，产品质量不高，极大限制了普鲁兰多糖在国内食品行业尤其是农产品保鲜方面的广泛应用。目前，出芽短梗霉被认为是生产普鲁兰多糖的优良菌株，但是目前不同菌株的多糖生产能力参差不齐，并且大多出芽短梗霉菌株在发酵后期会产生黑色素，不易去除，导致普鲁兰多糖后续的纯化成本升高。因此获得不产黑色素的普鲁兰多糖高产菌株是解决以上问题的关键。常压室温等离子体(ARTP)诱变技术，是利用大气压射频辉光放电(RFAPGD)等离子体技术对生物体进行诱变的一种诱变育种技术。它具有等离子体射流温度低、放电均匀、化学活性粒子浓度高、操作简便、安全性高、诱变快速及突变率高等特点，已成为一种应用广泛的、快速高效的新型生物诱变育种方法。但目前未见关于使用ARTP诱变普鲁兰多糖生产菌株出芽短梗霉以提高多糖产量的报道。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术提供了一种高产普鲁兰多糖的微生物菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M，该菌株于2017年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCCM2017498，保藏地址为中国武汉。为了解决上述提高普鲁兰多糖产量的技术问题，本专利技术提供了一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M，该高产普鲁兰多糖突变株菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M产量大于或等于60g/L，产普鲁兰多糖的能力为野生出芽短梗霉菌株的1.5-1.7倍左右；出芽短梗霉菌株诱变后单菌落大小与原始菌株单菌落相当，菌落形态规则、菌落中间凸起、质地坚硬、周围呈明显褶皱。本专利技术的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括下述的步骤：(1)摇瓶种子培养：采用保藏编号为CCTCCM2017498的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M为生产菌株，活化培养；(2)将步骤(1)中经过活化培养的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M转接到发酵培养基中进行发酵培养，66h后离心收集发酵上清液，用2倍体积的95％乙醇沉淀多糖，真空干燥。更具体的，本专利技术提供的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括下述的步骤：(1)菌株活化培养的步骤：将出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M牛奶冷冻管解冻，转接于斜面培养基上，于恒温培养箱中28℃培养2d；再转接于斜面培养基中，于恒温培养箱中28℃培养2d，连续传代6次，得到第六代斜面培养物；(2)摇瓶种子培养的步骤：采用保藏编号为CCTCCM2017498的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M为生产菌株，从第六代斜面取两环培养物，转接于种子培养基中，于28℃恒温摇床中200rpm振荡培养24h，获得种子培养液。(3)摇瓶发酵培养的步骤：将步骤(2)所得种子培养物按5％接种量转接到已灭菌的80mL发酵培养基(500mL摇瓶)中，于28℃恒温摇床中200rpm振荡培养66h。(4)10L发酵罐小试发酵培养的步骤：将种子培养液按5％接种量转接到已灭菌的发酵罐培养基中，发酵温度为28℃，通风搅拌发酵60-66h，搅拌速度为350rpm，通风比为1:1。(5)1m3发酵罐中试发酵培养步骤：将种子培养液按5％接种量转接到已灭菌的发酵罐培养基中，发酵温度为28℃，通风搅拌发酵60-66h，搅拌速度为220rpm，通风比为1:0.6。(6)沉淀多糖的具体步骤：将发酵液于冷冻离心机4℃、10,000rpm离心20min收集发酵上清液，取上清液加2-4倍体积的95％乙醇后不断搅拌沉淀多糖，4℃冰箱中静置12h使多糖充分沉淀，于冷冻离心机中4℃、10,000rpm离心15min得沉淀，将沉淀于真空干燥机中烘干得普鲁兰多糖。本专利技术的有益效果在于，本专利技术所获得的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M产普鲁兰多糖的量达到了60g/L，产普鲁兰多糖的能力为野生出芽短梗霉菌株的的1.5-1.7倍，且不产黑色素。使用ARTP诱变技术诱变出芽短梗霉提高普鲁兰多糖产量是首次报道，并且效果明显，能有效降低工业生产普鲁兰多糖的生产成本，解决了由于普鲁兰多糖生产水平较低，产品质量不高，极大限制了普鲁兰多糖在国内食品行业尤其是农产品保鲜方面的广泛应用这一技术问题。附图说明图1原始菌株菌落形态及菌体形态(奥林巴斯光电显微镜AH-2油镜)；图2原始菌株的生长曲线；图3出芽短梗霉AS3.3984的ARTP诱变致死率曲线；图4原始菌株与突变菌的菌落形态比较；图5原始菌株与突变菌发酵72h的普鲁兰多糖产量比较；图6原始菌株与突变株的普鲁兰多糖粗多糖；图7原始菌株与突变菌的产普鲁兰多糖曲线。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式来对本专利技术作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本专利技术，但并不以此限制本专利技术。实施例1原始菌株的鉴定原始菌株出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，该菌株的保藏编号是：AS3.3984。经ITS特征序列及18SrRNA基因序列扩增并测序，结果表明菌株AS3.3984与出芽短梗霉菌株YY16序列相似度为99％，确定其为出芽短梗霉。测序由金唯智生物科技(北京)有限公司完成。实施例2出芽短梗霉AS3.3984的ARTP诱变及高产突变株的筛选2.1原始菌株的活化配制斜面培养基：葡萄糖15-20g/L、酵母浸粉8-10g/L、蛋白胨15-20g/L及琼脂粉15-20g/L，pH自然，分装至试管中，加塞，115℃灭菌30min后制成试管斜面(18mm×180mm)，备用；配制固体平板培养基：配方同斜面培养基，115℃灭菌30min，冷却至约50℃，倒至灭菌平皿中，备用。将出芽短梗霉AS3.3984牛奶冷冻管解冻，转接于斜面培养基上，于恒温培养箱中28℃培养2d；转接平板，于恒温培养箱中28℃培养3d，待长出单菌落，在固体平板上28℃恒温培养3d后，可见单菌落呈乳黄色，菌落质地由粘稠状到坚硬和革状，菌落边缘规则，中间凸起(图1A)。挑取单菌落，结晶紫染色后，在奥林巴斯光电显微镜AH-2油镜下观察，可见出芽短梗霉AS3.3984呈椭圆酵母状(4×100，图1B)。挑取单菌落，再转接于斜面培养基中，于恒温培养箱中28℃培养2d，连续传代6次，得到第六代斜面培养物。2.2原始菌株种子液的培养配制种子培养基：葡萄糖15-20g/L、酵母浸粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(

【技术特征摘要】
1.一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M，其特征在于，该菌株于2017年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCCM2017498。2.如权利要求1所述的一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M，该菌株产普鲁兰多糖的能力为野生出芽短梗霉菌株的1.5-1.7倍。3.如权利要求1所述的一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M，其特征在于，出芽短梗霉菌株单菌落大小与原始菌株单菌落相当，菌落形态规则、菌落中间凸起、质地坚硬、周围呈明显褶皱。4.如权利要求1所述的一种高产普鲁兰多糖的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M，其特征在于，出芽短梗霉菌株产普鲁兰多糖量大于或等于60g/L。5.如权利要求1所述的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括下述的步骤：（1）摇瓶种子培养：采用保藏编号为CCTCCM2017498的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M为生产菌株，活化培养；（2）将步骤（1）中经过活化培养的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M转接到发酵培养基中进行发酵培养，66h后离心收集发酵上清液，用2倍体积的95%乙醇沉淀多糖，真空干燥。6.如权利要求5所述的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，菌株活化培养的步骤是：将出芽短梗霉菌株牛奶冷冻管解冻，转接于斜面培养基上，于恒温培养箱中28°C培养2d；再转接斜面，28°C恒温培养，连续传代6次。7.如权利要求5所述的出芽短梗霉菌株(Aurebasidiumpullulans)NCPS2016-M发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，发酵培养的步骤是：将活化后所得的菌株接种于已灭菌的装有种子培养基的锥形瓶中，培养温度为28°C，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金玉，赵双枝，陈蕾蕾，张彦昊，王易芬，孙华，张翔，
申请(专利权)人：山东省农业科学院农产品研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37