原核增强子样序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及具有原核ＤＮＡ转录增强子活性的ＤＮＡ片段，其筛选和克隆方法及其在制备重组表达载体中的应用。本发明专利技术的新的增强子样序列明显的改善了外源基因的转录速率，进而明显地提高了外源目的基因表达产物的产率。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的具有转录增强子样活性的核苷酸序列、其克隆和筛选方法，以及所说的核甘酸序列在构建原核表达载体中的应用。可从大肠杆菌菌株或痘苗病毒基因组中克隆得到本专利技术的转录增强子样序列。使用插入了本专利技术的增强子样核苷酸序列并携带编码感兴趣的蛋白质编码序列的重组表达载体转化适当的宿主细胞，可显著地提高重组基因的转录效率，从而大大增加所说是蛋白质表达产物的产率。基因表达的调控是微生物学研究中的一个十分复杂的课题。已知外源基因的表达水平在转录和翻译水平上受到许多功能性核苷酸序列和转录结合因子(如结合蛋白)的影响。真核基因转录的效率主要反映起始转录时限速反应的速率，并且受到两类调节元件，即启动子元件和调节子元件的控制。其中启动子元件是精确有效地启动转录开始所必需的，而调节子元件的功能在于增强或减弱启动子的转录效率。调节子元件，特别是增强子则是当基因转录激活时可远距离(一般在RNA转录起始位点100bp以上)对启动子发挥顺式作用的基因组元件。八十年代初，Banerji等人(Cell 27299-304，1981)首先发现真核病毒SV40基因组中存在有增强基因转录效率的增强子序列。继后进一步发现这一基因转录调节序列广泛存在于真核细胞及其病毒基因组中(参见Muller，M.M.et al.，J.biochem.178485-496，1988)。1985年，本专利技术人首次发现SV40的Hind III B片段在大肠杆菌内距离启动子约1000bp处仍表现有明显地增强外源基因(如HuINFα、β)表达的活性(吴淑华等，病毒学报，1385-388，1985；侯云德等，病毒学报，1278-281，1985)。同时，发现大肠杆菌glnA P2启动上游有增强子样序列(如参见McClure，W.R，Am.Rew.Biochem.54171-204，1985)。此后，研究者又相继发现了一系列具有转录调节作用的增强子序列，其中包括调节氮源吸收和固定的Ntrc增强子(Back，M.et al.Nature 320374-378)和NifA增强子(Reiter，L.and Magasanik，B.，Cell 45785-792，1986)，以及T4晚期基因增强子(Herendeen，D.R.et al，Science 245952-958，1989)等。研究者们已对原核增强子的结构特征和作用机理进行了广泛地研究(如参见Kustu.S.et al，TIBS 16397-402，1991)，并在此基础上为进一步阐明大肠杆菌DNA结合蛋白和转录激活机制进行了更为深入地探讨。例如，已显示大肠杆菌Trp和PL启动子上游富含A/T区域对增强转录活性具有重要作用(Nishi，T.et al，Gene 4429-36，1986)，并可显著地提高外源。结构基因的表达水平(Latta，M.DNA and Cell Biol.9129-137，1990)。特别是近年来在深入研究σ54型增强子的基础上，进一步发现增强子实际上是以不同形式参予转录调节的多种蛋白质因子的DNA结合位点。业已发现，这类原核增强子样序列具有某些共同的特征1，可在距离启动子上游0.3-1.0kb处发挥其作用，以致使结构基因的表达水平提高4-11倍；2，其转录增强效应没有明显的方向性，即增强子相对于启动子的方向与其活性无关；3，位置效应，即增强子无论位于启动子的上游或下游，均表现有转录增强活性；4，原核增强子对启动子转录作用的增强活性与其来源关系不大，例如病毒或噬菌体来源的增强子对原核启动子和痘苗病毒启动子均有作用；5，具有一定的宿主特异性或组织专一性。与此同时，为了开发原核增强子在生物工程产业中的应用，本专利技术人利用我们自己构建的筛选质粒和检测质粒，建立了直接从大肠杆菌基因组中克隆并筛选具有原核增强子样活性的DNA片段的方法(例如参见孙乃思等，分子遗传学，南京大学出版社1990年版，中国南京)，并相继从大肠杆菌(如JM103和MC1061细胞株)和真核细胞病毒(如乳头状瘤病毒、呼吸道合胞病毒及痘苗病毒)中发现并克隆了一系列具有重要的实用价值的原核增强子样序列。例如，已授权的中国专利95106219.0公开了从大肠杆菌JM103染色体DNA中分离的具有增强子样活性的894bp片段、RSV的G片段、痘苗病毒基因组中的HindIIIK片段和SV40 Hind III B片段。另外，该文献还公开了这些片段在构建高效表达载体(如质粒PBV320及其衍生物)中的应用。在已有研究成果的基础上，本专利技术人利用我们自己构建的原核增强子检测系统和工具载体，进一步从具有极好安全性的K12系大肠杆菌C600菌株和痘苗病毒天坛株中分离并克隆了具有原核增强子样活性的新的核苷酸片段，初步分析了这些片段的结构和功能，并在此基础上研究了这些片段在构建新的原核表达载体中的应用，从而完成了本专利技术。本专利技术的一个目的是提供具有原核DNA转录增强子样活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所说的片段是大肠杆菌来源的，并且具有如附图说明图1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的是提供具有原核DNA转录增强子样活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所说的片段是大肠杆菌来源的，并且具有如图2(SEQ ID NO2)所示的核苷酸序列。根据本专利技术上述目的的优选实施方案，其中所说的大肠杆菌是大肠杆菌C600菌株。本专利技术的再一个目的是提供具有原核DNA转录增强子样活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所说的片段是痘苗病毒来源的，并且具有如图5(SEQ ID NO3)所示的核苷酸序列。本专利技术的再一个目的是提供具有原核DNA转录增强子样活性的DNA片段或其功能等同物，其特征在于所说的片段是痘苗病毒来源的，并且具有如图6(SEQ ID NO4)所示的核苷酸序列。根据本专利技术上述目的的优选实施方案，其中所说的痘苗病毒是痘苗病毒天坛株。本专利技术的再一个目的是提供如上限定的具有原核DNA转录增强子样活性的DNA片段或其功能等同物在构建重组表达载体并提高外源基因表达产物的产率中的应用。图1显示具有原核增强子样生物学活性的，来源于大肠杆菌C600并定名为3A的DNA片段的核苷酸序列。图2显示具有原核增强子样生物学活性的来源于大肠杆菌C600并定名为8A的DNA片段的核苷酸序列。图3显示用于筛选本专利技术的大肠杆菌C600来源之原核增强子样DNA片段的重组载体pKT和pKTK的构建。图4A显示CAT基因序列转录本(mRNA)的斑点印迹杂交结果。其中泳道1和2分别为携带8A和3A片段的质粒DNA提取物，泳道3为pKN2对照质粒DNA提取物，泳道4为酵母tRNA样品(阴性对照)。图4B显示LacZ基因序列转录本(mRNA)的斑点印迹杂交结果。其中泳道1和2分别为携带8A和3A片段的质粒DNA提取物，泳道3为pKN2d对照质粒DNA提取物，泳道4为酵母tRNA样品。图5显示具有原核增强子样生物学活性的，来源于痘苗病毒天坛株并定名为VV1的DNA片段的核苷酸序列。其中黑体字母显示富含AT区，斜体字母显示相邻的24bp重复序列。图6显示具有原核增强子样生物学活性的，来源于痘苗病毒天坛株并定名为VV16的DNA片段的核苷酸序列。其中黑体字本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有原核ＤＮＡ转录增强子样活性的ＤＮＡ片段或其功能等同物，其特征在于所说的片段是大肠杆菌来源的，并且具有如图１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴淑华，侯云德，何建新，秘晓林，韩峰，曹茹，王艳，
申请(专利权)人：中国预防医学科学院病毒学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]