猪瘟病毒（CSFV）E2抗原原核高效表达质粒的构建及CSFVE2抗原大规模生产工艺制造技术

本发明专利技术公开一种猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）Ｅ２抗原原核高效表达质粒的构建及ＣＳＦＶ Ｅ２抗原大规模生产工艺，ＣＳＦＶ Ｅ２基因的４条寡聚核苷酸突变引物，以重组ＰＣＲ技术改造了Ｅ２基因５′端０．３６ｋｂ的基因序列，然后将其与Ｅ２基因３′端的序列相连接，得到全长Ｅ２基因，并将该基因克隆至ｐＥＴ－２８ａ（＋）中，得到表达全长Ｅ２基因的原核表达质粒ｐＥＴＥ２。将ｐＥＴＥ２转入至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙＳｓ中，在ＩＰＴＧ的诱导下，转化菌均可高效表达目的基因，表达量在３０％－４５％之间。这是ＣＳＦＶ全长Ｅ２基因首次在Ｅ．ｃｏｌｉ中的高效表达和大量生产。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及猪瘟病毒(CSFV)E2抗原核高效表达质粒的构建，并且提供了CSFV E2抗原大规模生产工艺，属于猪瘟病毒基因工程
技术介绍
关于猪瘟病毒(CSFV)E2基因在大肠杆菌中的表达，至今，只有我们实验室在大肠杆菌中进行了CSFV全长E2基因的表达，该结果请见(1)畜牧兽医学报，30(2)146-152，1999。但其表达水平特别低，仅能用高度敏感的方法才能检测到，没有实用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在猪瘟病毒(CSFV)E2抗原核高效表达质粒的构建，并且提供了其在大肠杆菌大规模生产工艺，提高CSFV E2在大肠杆菌表达量，为大量生产CSFV E2论断抗原提供一可靠的方法。本专利技术的技术解决方案如下1、猪瘟病毒(CSFV)E2基因在大肠杆菌中的高效表达质粒的构建通过计算机分析设计了CSFV E2基因的4条寡聚核苷酸突变引物，以重组PCR技术改造了E2基因5′端0.36kb的基因序列，然后将其与E2基因3′端的序列相连接，得到了改造好的全长E2基因，并将该基因克隆至pET-28a(+)中，得到表达全长E2基因的原核表达质粒pETE2。具体步骤如下(1)根据CSFV石门株E2基因的核苷酸序列和用计算机对E2基因的分析结果设计以下4条突变引物MP1GGAATTCATGCGCTTAGCCTGCAAGGAAGATTACCGTTACGCAATCTCATCAACCAATGAGATTGGGTTACTCGMP2TGCCAggTACCggCgACTGACCACATTAAGTGCMP3AGTcGccGGTAccTGGCATCATTGCATAAGGGMP4CGGAATTCAaATTGGGCAGACAAGGTAG(2)重组PCR克隆mE2以上述4条寡聚核苷酸为引物，质粒pHCE2为模板，以重组PCR技术改造了E2基因5′端0.36kb的基因序列，然后将其与E2基因3′端的序列相连接，得到了改造好的全长E2基因，并将该基因克隆至pET-28a(+)中，得到表达全长E2基因的原核表达质粒pETE2。(3)mE2重组表达质粒的构建用Bam HI、Hind III同时分别酶切pBME2和pET-28a(+)，用Agarose Gel ExtractionKit(B.M)回收mE2，最后将mE2插入到pET-28a(+)的Bam HI、Hind III两位点之间，构建成表达质粒pETE2。(4)全长E2基因重组表达质粒的构建以Sac I和Xhol I双酶切pETME2回收大片段，同时以Sac I和Xhol I双酶切和pcDSW，回收得到780pb的片段，将2片段以T4DNA连接酶相连接，得到表达全长E2基因的原核表达质粒pETE2。2.猪瘟病毒(CSFV)E2基因原核表达质粒pETE2在大肠杆菌中的高效表达E2基因，大量生产出CSFV E2诊断抗原。步骤包括将pETE2转化感受态菌BL21(DE3)plysS，挑取单个BL21(DE3)plysS的pETE2转化菌，将它们接种至适量的含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600达到0.6～1.0，4℃冰箱过夜，第2天将培养物用LB洗涤一遍，然后将它们分别接种至新鲜的含30μg/ml卡那霉素的LB中，于37℃振荡培养至OD600达到0.6～1.0，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，继续培养2.5～5小时。同时培养、诱导含pET-28b(+)受体菌。将经过诱导的细菌培养物于4℃ 5000RPM离心10min，收集细菌，加入1/5原培养物体积的冰预冷的50mmol/L Tris HCl，2mmol/L EDTA(pH8.0)，洗涤菌体一次，离心收集菌体重悬于1/10，原培养物体积的冰预冷的10mmol/L TrisHCl(pH8.0)中，置4℃备用。取30ul菌液进行SDS-PAGE电泳，结果表明pETE2转化菌可表达分子量为40.43kD的E2蛋白，用双波长飞点扫描仪，对上述SDS-PAGE凝胶电泳的蛋白带进行扫描，扫描结果表明E2的表达量在30％-45％之间。本专利技术的积极效果在于将重组蛋白纯化后，以CSFV阴阳性血清进行检测，该重组蛋白可与阳性血清发生明显的反应，而不与阴性血清发生反应。以此纯化的重组蛋白建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，该方法可用于猪瘟的辅助诊断和猪瘟疫苗接种后的免疫监测。具体实施例方式实施例1根据CSFV石门株E2基因的核苷酸序列和用计算机对E2基因的分析结果设计以下4条寡聚核苷酸突变引物MP1GGAATTCATGCGCTTAGCCTGCAAGGAAGATTACCGTTACGCAATCTCATCAACCAATGAGATTGGGTTACTCGMP2TGCCAggTACCggCgACTGACCACATTAAGTGCMP3AGTcGccGGTAccTGGCATCATTGCATAAGGGMP4CGGAATTCAaATTGGGCAGACAAGGTAG以pHCE2为模板，MP1、MP2和MP3、MP4分别扩增mE2的5’端(mP12)和3’端(mP34)。循环参数为95℃ 50sec，52℃ 50sec，72℃20sec，25个循环，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。用Agarose GelExtraction Kit(B.M)分别回收PCR产物mP12和mP34。然后，以回收的mP12和mP34等摩尔数的混合物为模板，以MP1和MP4为引物，扩增mE2。扩增条件为以下两个程序程序195℃ 50sec，40℃ 50sec，72℃ 25sec，5个循环程序295℃ 50sec，52℃ 50sec，72℃ 25sec，10个循环如上鉴定和回收PCR产物mE2。用EcoRI、BamHI同时分别酶切mE2和pBluescript II KS(+)，然后，将两者以T4连接酶连接，将mE2克隆到pBluescript II KS(+)中构建成中间质粒pBME2。用Bam HI、Hind III同时分别酶切pBME2和pET-28a(+)，用Agarose Gel ExtractionKit(B.M)回收mE2，最后将mE2插入到pET-28a(+)的Bam HI、Hind III两位点之间，构建成表达质粒pETME2。以Sac I和Xhol I双酶切pETME2回收大片段，同时以Sac I和Xhol I双酶切和pcDSW，回收得到780pb的片段，将2片段以T4DNA连接酶相连接，得到表达全长E2基因的原核表达质粒pETE2。实施例2 CSFV E2抗原的生产将pETE2转化感受态菌BL21(DE3)plysS，挑取单个BL21(DE3)plysS的pETE2转化菌，将它们接种至10ml的含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600达到0.6～1.0，4℃冰箱过夜，第2天将培养物用LB洗涤一遍，然后将其接种至1000ml新鲜的含30μg/ml卡那霉素的LB中，于37℃振荡培养至OD600达到0.6，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，继续培养3小时。将经过诱导的细菌培养物于4℃ 5000 RPM离心10min，收集细菌，加入200ml冰预冷的50mmol/L Tris HCl，2mmol/L EDTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）Ｅ２基因在大肠杆菌中的高效表达质粒的构建，其特征在于４条寡聚核苷酸突变引物为：ＭＰ１：ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＣＣＧＴＴＡＣＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＴ ＴＧＧＧＴＴＡＣＴＣＧＭＰ２：ＴＧＣＣＡｇｇＴＡＣＣｇｇＣｇＡＣＴＧＡＣＣＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＣＭＰ３：ＡＧＴｃＧｃｃＧＧＴＡｃｃＴＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＡＴＡＡＧＧＧＭＰ４：ＣＧＧＡＡＴＴＣＡａＡＴＴＧＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧＧＴ ＡＧ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：余兴龙，涂长春，张茂林，
申请(专利权)人：中国人民解放军军需大学军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]