O型口蹄疫病毒O_NY00株基因组序列制造技术

一种Ｏ型口蹄疫病毒Ｏ＿ＮＹ００株基因组序列，属于生物技术领域。本发明专利技术是采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、分子克隆和核酸序列测定技术，对本室分离、保存的中国Ｏ型口蹄疫ＮＹ００株的全基因组进行了分段扩增、克隆及序列测定，构建了基因组ｃＤＮＡ文库，测定了７．６ｋｂ的核苷酸序列。对中国Ｏ型口蹄疫ＮＹ００株的全基因组进行分段扩增、克隆及序列测定，并构建基因组ｃＤＮＡ文库，然后从该文库中亚克隆出免疫相关基因插入表达载体中，制备安全、高效、可靠的基因工程疫苗和诊断试剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别是涉及一种O型口蹄疫病毒NY00株的全基因组序列。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的最烈性传染病之一，也是对人类健康造成一定危害的人畜共患传染病。口蹄疫呈世界性流行，黄牛、猪、绵羊、山羊、水牛等家畜均易感。本病传播迅速，覆盖面广，每次流行几乎都给当地畜牧业带来灾难性损失。因此各国对于口蹄疫的防疫和检疫高度重视。二十世纪八十年代以来，应用基因工程技术研究和开发新型口蹄疫疫苗和诊断试剂已成为国内外学者关注的焦点。而扩增、克隆并测定口蹄疫病毒的基因组的核苷酸序列，是进行上述研究和开发工作的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、分子克隆和核酸序列测定技术，对本室分离、保存的中国O型口蹄疫NY00株的全基因组进行了分段扩增、克隆及序列测定，构建了基因组cDNA文库，测定了7.6Kb的核苷酸序列。对中国O型口蹄疫NY00株的全基因组进行分段扩增、克隆及序列测定，并构建基因组cDNA文库，然后从该文库中亚克隆出免疫相关基因插入表达载体中，制备安全、高效、可靠的基因工程疫苗和诊断试剂。本专利技术提供了中国O型口蹄疫病毒O_NY00株的全基因组核苷酸序列和氨基酸序列。将中国O型口蹄疫病毒NY00株基因组分段扩增并克隆到pGEM-T或pGEM-T Easy载体中，构建了pTL、pTP1、pTP2和pTP3四个质粒，建立口蹄疫病毒基因组cDNA文库。将免疫相关基因构建的cDNA文库中亚克隆到表达载体中，在宿主细胞中表达出相应基因，可作为预防或诊断口蹄疫的多肽、蛋白质、基因重组体或重组免疫原。表达载体可以是原核表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体、植物表达载体以及相关真核表达载体。免疫相关基因可以是P1、VP1、2A、2C、3ABC、3D以及人工合成的核苷酸或氨基酸片段。本专利技术的优点和积极效果在于扩增、克隆并测定了中国O型口蹄疫O_NY00株基因组的核苷酸序列。同时构建了含该毒株全基因组的文库。本专利技术可从该文库中亚克隆出目的基因用于口蹄疫新型疫苗、诊断试剂以及其他相关基因工程产品的研究和开发。附图说明图1是中国O型口蹄疫病毒NY00株的基因组cDNA文库结构。具体实施例方式1、病毒的培养与总RNA的提取 (1)病毒的培养将保存的1953年牛口蹄疫水泡皮病料，用生理盐水1∶5研磨，4℃浸毒过夜后，-40℃保存备用。不合实验要求的病料研磨后，接种3~5日龄乳鼠，连传3~5代，乳鼠出现典型症状后，将胴体用生理盐水1∶5研磨，4℃浸毒过夜后，-40℃保存备用。(2)毒型鉴定采用反向间接红细胞凝集试验(标准抗原和口蹄疫A、O、C、Asia I、猪水泡病诊断液等购自兰州兽医研究所)鉴定其血清型为O型，具体方法参考文献进行。(3)总RNA的提取用Trizol(INVETROGEN公司，原GIBCO BRL公司产品)试剂盒提取总RNA。将处理好的病料研磨液，3000rpm离心5min，取350ul上清与700ul Trizol振荡混匀，冰浴10min。加氯仿350ul，振荡混匀后静置1Omin待其分层，4℃ 12000rpm离心10min。收集上清到另一离心管内，加入氯仿350ul，振荡混匀后静置10min待其分层，4℃12000rpm离心5min。收集上清到另一离心管内，加入等体积异丙醇，-20℃ 1hour，4℃ 12000rpm离心20min。小心倾去异丙醇，加入250ul 70％冰预冷乙醇(DEPC水配制)洗涤，弃去。37℃干燥后，加入20ul DEPC(二乙酯焦碳酸)水。2、病毒基因组的分段RT-PCR(1)病毒RNA的反转录提取的总RNA加入反转录缓冲液(5×)、DNTP、随机引物和RNA酶抑制剂，70℃水浴5min，再加入反转录酶(Promega公司的AMV)，反应体系总体积为20ul，42℃反应1h。(2)病毒基因组的分段PCR取3ul反转录产物加PCR缓冲液、DNTP、氯化镁、上游引物、下游引物和去离子水和Ex-Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)，总体积为25ul，混匀后进行扩增。具体引物及扩增程序如下。5’非编码区上游引物为5`-AGGGCTGTGACCGCAAGATCATAC-3`，下游引物为5`-CCAAGTTGCGTGTCCATGGAGTTCT-3`；扩增程序为98℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。片段大小为1361bp。P1-2A区上游引物为5`-CATGCAATCTGGCAACACTGGCAGC-3`，下游引物为5`-CTTAGAAGGGCCCAGGGTTGGACTC-3`；扩增程序为98℃预变性5min，94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。片段大小为2231bp。P2区上游引物为5`-CCTGGGCCCTTCTTCTTCTCTGAC-3`，下游引物为5`-CTTGAAAATCGGGTGGCTCGACAC-3`；扩增程序为98℃预变性5min，94℃变性1min，46.5℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。片段大小为1416bp。P3区上游引物为5`-GCATGGCCGTTGAAATGAAGAGAA-3`，下游引物为5`-CTACCGTGACATCTGAGGGATTAG-3`；扩增程序为98℃预变性5min，94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min。片段大小为2887bp。3、目的DNA的克隆与阳性克隆菌鉴定(1)目的DNA的纯化用WizardDNA纯化试剂盒(Promega公司产品)从PCR二扩产物中纯化目的DNA，具体按试剂盒操作说明进行。(2)目的DNA与载体的连接纯化的目的DNA与pGEM-T(用于5’非编码区、P2区、P3区基因)或pGEM-Teasy(用于P1-2A基因)与载体连接，具体操作是在离心管中按下列组成调制连接反应液，体系为15ul；2×快速连接缓冲液7.5ul，载体1ul，PCR回收产物2.5ul，T4 DNA连接酶(3WU/ul)1ul，然后用灭菌双蒸水将体系定容到15ul；将反应液混匀；4℃连接过夜。(3)感受态细胞的制备感受态细胞工程菌JM109 500ul加入50ml LB培养基中，37℃震荡培养(250-300rpm)2到3小时；冰浴10分钟，使菌液冷却；无菌操作转移入50ml离心管中，4℃4000rpm10分钟；弃上清，加入新配0.1M CaCl2(预冷)20ml，吹打沉淀，冰浴45分钟；4℃4000rpm 8分钟；弃上清，加入0.1 CaCl2甘油1-2ml，重悬；按100-200ul每管分装入离心管，-40℃保存。(4)转化向200ul感受态细胞中加入连接产物5ul，用Tip头轻轻搅匀；冰浴30分钟；42℃热击90秒，不振荡，并快速移至冰上3分钟；加入37℃预热的LB 800ul，37℃振荡培养45分钟；4000rpm2分钟；弃部分上清，约留200ul，混匀；均匀涂布在加有16ul X-gal(50mg/ul)和4ul IP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｏ型口蹄疫病毒ＮＹ００株的全基因组序列，其特征在于：该基因组序列如表１：表１：中国Ｏ型口蹄疫病毒Ｏ＿ＮＹ００株的全基因组核苷酸序列和氨基酸序列分析ＡＧＧＧＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＡＣＣＧＣＣＴＴＴＣＣＣＧＧＣ ＧＴＴＡＡＴＴＧＧＡＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＡ　９０ＴＴＣＧＣＣＴＡＧＴＴＴＴＧＣＣＣＧＴＴＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＧＧＧＡＣＧＴＣＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＣ ＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＣＡＣＧＡＴＣＴ　１８０ＡＴＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＡＣＡＡＣＣＧＡＣＡＣＡＡＡＣＣＧＴＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＧＴＡＣＴＧ ＴＧＣＴ　２７０ＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＧＧＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＧＴＡＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＧＴＡ　３６０ＡＣＡＧＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧ ＧＧＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＡＡＣＴＴＴＡＣＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡ　４５０ＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧ ＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＡＡＣＡＣＧＣＧＡＣＡＣＴＣＧＧＧＡＴＣＴＧ　５４０ＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＣＧＣＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＧＴ ＧＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡ　６３０ＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＴＡＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＴＴＧＴＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＧＡＴＴＡＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＴＡＴＣＡＣＧＡＧＣ ＡＣＡＡ　７２０［ＯＲＦ］Ｍ　Ｓ　Ｔ　Ｔ　Ｄ　Ｃ　Ｆ　Ｉ　Ａ　Ｌ　Ｌ　Ｈ　Ａ　Ｆ　Ｒ　Ｅ　Ｉ　Ｋ　Ｔ　Ｌ　Ｆ　Ｌ　Ｓ　Ｒ　Ａ　ＱＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡ ＧＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣ　８１０Ｇ　Ｋ　Ｍ　Ｅ　Ｆ　Ｔ　Ｌ　Ｙ　Ｎ　Ｇ　Ｅ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑敏，金宁一，张洪勇，刘棋，李昌，尹革芬，韦婷，郭建刚，金扩世，
申请(专利权)人：中国人民解放军军需大学军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]