糖基化合物的甲基化转移酶基因制造技术

本发明专利技术涉及一个糖苷类化合物的甲基转移酶基因，可在体外将糖苷类化合物中糖基的4位羟基进行甲基化修饰，同时可以同萄糖基转移酶协同作用，通过组合生物合成转化包括聚酮类，黄酮类，蒽醌类等在内的不同活性物质，从而获得有别于这些天然产物结构的新型活性化合物，实现化合物的定向生物转化，增强化合物的稳定性。

Methyltransferase gene of glycosyl compounds

The invention relates to a methyl glycosides transferase gene in vitro, 4 hydroxy glycosides of sugar based methylation, and synergism with glucosyl transferase, including polyketides, flavonoid biosynthesis through a combination of transformation, different kinds of active substances, and anthraquinone. To obtain the new active compounds in these natural products, to achieve directional conversion of biological compounds, enhance the stability of compounds.

【技术实现步骤摘要】
糖基化合物的甲基化转移酶基因
：本专利技术涉及一个可将糖基化物质中的葡萄糖4位羟基甲基化的基因，所述糖基化物质具体包括聚酮类，黄酮类，-的糖基化衍生物。
技术介绍
：各种天然及非天然的糖基化物质容易受到来自生物体及外界的多种因素的影响，导致自身降解，活性降低。如果将这些物质中糖基的4位羟基烷基化，有利于增强其稳定性。真菌生物转化是利用细胞内特定的酶对外源化合物进行结构修饰与改造，从而获得更有价值的代谢反应。
技术实现思路
:本专利技术的目的是获得可参与糖基化合物中糖基的4位羟基甲基化的O-甲基转移酶基基因，实现糖基化化合物的体外甲基化修饰，获得新型结构及活性的天然产物，增强其稳定性。本专利技术筛选了球孢白僵菌，从中获得了一个特殊的O-甲基转移酶，命名为BbFkbM。通过人工合成葡糖O-甲基转移酶基因BbFkbM，构建了可在酵母菌中表达的重组质粒，同实验室已有的葡糖基转移酶异源表达载体共转入酵母，并在酵母中进行异源表达转化。通过外源添加不同糖基化衍生物，或与葡糖基转移酶进行组合生物合成，从发酵产物中提取得到了与原化合物结构不同的糖甲基化产物。经实验证实，本专利技术的O-甲基转移酶基基因通过异源表达，可对多种黄酮类，聚酮类糖基化衍生物进行甲基化修饰，所得到的产物较未修饰前稳定性增强，可抵消酵母中糖苷水解酶的降解作用，增强了在生物体内的稳定性。而且，本专利技术还发现所述O-甲基转移酶BbFkbM的同源基因存在于不同的虫生真菌中，具有相同的功能。可与不同的糖基转移酶进行组合生物合成，修饰不同的天然活性产物，为先导化合物的发现及药物的定向转化提供了新的研究方法与途径。具体如下：1、获得BbFkbM基因通过基因组测序和相关预测软件对糖基转移酶的结构分析，设计引物，由cDNA扩增获得球孢白僵O-甲基转移酶基因BbFkbM。其中，BbFkbM核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2、葡糖基转移酶BbFkbM酵母表达载体构建与酵母转化将含有完整的BbUGT86的DNA片段连接到PXW06F载体上，构建了组成型表达质粒PXW06F-BbFkbM，同时和葡糖基转移酶异源表达载体PRS425m-BbUGT86转入营养缺陷型酵母受体BJ5464进行异源表达中。3、重组子的筛选共同将表达载体转入不能合成亮氨酸、色氨酸的缺失酵母菌中，利用亮氨酸、色氨酸营养缺陷型标记筛选重组子。4、聚酮类化合物饲喂转化试验及转化产物HPLC液相分析重组菌株培养过程中分别添加聚酮类化合物Desmethyl-Lasiodiplodin(以下称为化合物1)，发酵转化产物用有机溶剂提取，并进行HPLC液相分析，核磁共振分析产物结构。发现化合物1几乎全部转化。液相结果显示除了化合物1的峰外还得到了另外一个峰。分离产物进行进一步的结构分析证明得到了与天然产物化合物1不同结构的聚酮类化合物2，经质谱分析发现化合物2是在原产物化合物1的5位碳原子的羟基上加上了一个葡萄糖，同时葡萄糖4位上的羟基甲基化。证明了O-甲基转移酶基因可用于对苯二酚内酯及其类似物的聚酮糖基化衍生物的结构进行修饰，很适合对各种活性化合物进行分子结构修饰，增加聚酮化合物库的多样性。重组菌株发酵产物色谱图及产物结构见图3。5、黄酮类化合物的饲喂转化试验及转化产物HPLC液相分析重组菌株培养过程中分别添加不同黄酮类化合物，发酵转化产物用有机溶剂提取，并进行HPLC液相分析，核磁共振分析产物结构。6.糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物在稳定性比较将纯化后的糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物分别添加到野生型的酵母发酵液中，培养相同的时间，通过提取粗提物进行HPLC液相分析，检测两种物质在酵母体内自身酶系作用下的稳定性。7.酵母糖苷水解酶EXG1对糖甲基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物稳定性的影响将纯化后的糖基化修饰产物化合物2与修饰前化合物糖基化衍生物分别添加到野生型和敲除糖苷水解酶EXG1的酵母发酵液中，培养相同的时间，通过提取粗提物进行HPLC液相分析，检测两种物质在酵母自身糖苷水解酶作用下的稳定性。8.虫生真菌中同源基因的功能验证通过获得的球孢白僵菌的糖基转移酶和O-甲基转移酶的氨基酸序列利用相关生物信息学软件进行比对从不同的虫生真菌中获得了DNA相似度大于30％、覆盖率大于90％的98个同源基因序列见表1。从DNA序列一致度50％、相似度70％、覆盖率99％以上的序列中挑选了玫烟色棒束孢Isariafumosorosea，罗伯特绿僵菌Metarhiziumrobertsii和紫色麦角菌Clavicepspurpurea中的3个O-甲基转移酶基因进行异源表达，NCBI中的序列号分别为XP_007822447.1、XP_018701797.1和CCE31609.1。这四个蛋白的活性中心的氨基酸序列一致性很高，极性相符(图31)。通过底物饲喂试验，均成功转化了聚酮类化合物1的糖基化衍生物，验证了真菌中同源的糖基转移酶和O-甲基转移酶的相似功能。表1O-甲基转移酶基因BbFkbM的同源基因列表序列表说明SEQIDNO.1BbFkbM的核苷酸序列；SEQIDNO.2由SEQIDNO.1推导出的BbFkbM编码的氨基酸序列。SEQIDNO.3IfOMT的核苷酸序列；SEQIDNO.4由SEQIDNO.3推导出的IfOMT编码的氨基酸序列。SEQIDNO.5MrOMT的核苷酸序列；SEQIDNO.6由SEQIDNO.5推导出的MrOMT编码的氨基酸序列。SEQIDNO.7CpOMT的核苷酸序列；SEQIDNO.8由SEQIDNO.7推导出的CpOMT编码的氨基酸序列。附图说明图1为BbFkbM基因片段的扩增结果；图2为重组载体PXW06F-BbFkbM的物理图谱；图3为化合物1修饰前的液相色谱图；图4是化合物1修饰后，产生了一个糖甲基化的化合物2的HPLC液相色谱图。图5-图19为所实验的底物黄酮样品转化后的糖甲基化产物的色谱图及质谱结果，其中：图5的F-3化合物转化前的色谱图及质谱结果；图6的F-4化合物转化前的色谱图及质谱结果；图7的F-5化合物转化前的色谱图及质谱结果；图8的F-6化合物转化前的色谱图及质谱结果；图9是F-7化合物转化后的色谱图及质谱结果；图10是F-8化合物转化后的色谱图及质谱结果；图11是F-11化合物转化后的色谱图及质谱结果；图12是F-12化合物转化后的色谱图及质谱结果；图13是F-15化合物转化后的色谱图及质谱结果；图14是F-16化合物转化后的色谱图及质谱结果；图15是F-20化合物转化后的色谱图及质谱结果；图16和图17分别为化合物3在培养24h和48h后的水解产物的液相色谱图；图18和图19分别为化合物2在培养24h和48h后的水解产物的液相色谱图；图20为EXG1敲除突变株PCR验证的电泳结果；图21和图22分别为化合物3在野生型及突变型酵母培养过程中的水解产物的液相色谱图；图23和图24分别为化合物2在野生型及突变型酵母培养过程中的水解产物的液相色谱图；图25到图27分别为重组载体PXW06F-IfOMT、PXW06F-MrOMT和PXW06F-CpOMT物理图谱。图28为化合物3经紫色麦角菌CpOMT修饰后，产生了一个糖甲基化的化合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糖苷类化合物甲基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种糖苷类化合物甲基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述基因在化合物体外的糖基化修饰中的应用。3.权利要求2所述的应用，是糖苷类化合物中糖基的4位羟基甲基化体外修饰。4.权利要求3所述的应用，所述糖苷类化合物是黄酮类和聚酮类的糖苷化合物。5.含权利要求1所述基因的重组质粒。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：张礼文，徐玉泉，谢李楠，王辰，王晓婧，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11