The present invention is a method for expression of restriction endonuclease SacI methylation protection strain screening method by methyltransferase M.AluI recombinant expression strains, establish the restriction enzyme SacI recombinant expression and other steps, the recombinant expression plasmid pBAD R.SacI was transformed sense by screening culture cell, obtain restriction enzyme SacI recombinant strain; the strain was cultured to expand in Arabia, sugar induced, recombinant protein restriction enzyme SacI. The method of the invention can realize efficient recombinant expression by restriction enzyme SacI; Arabia operon expression system on the bottom of the strict control of the restriction enzyme SacI recombinant expression; resistance to host genomic DNA restriction enzyme SacI digestion method is stable and efficient; M.AluI methylation protection screened strains can also be applied to other with limited enzyme recognition sites like recombinant expression.
【技术实现步骤摘要】
用于表达限制性内切酶SacI的甲基化保护菌株的筛选方法
本专利技术涉及一种菌株的筛选方法,特别是一种用于表达限制性内切酶SacI的甲基化保护菌株的筛选方法。
技术介绍
限制性内切酶是可以识别双链DNA序列特异序列并进行切割的核酸酶(Ch.8,eds.DeBruijin,etal.,Chapman&Hall,NewYork,78-92.1998),其发现促使DNA重组技术的诞生从而极大推动现代分子生物学和基因工程的发展,是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。在细菌中,限制性内切酶及其相应的甲基转移酶构成限制-修饰系统,以保护微生物不受外来噬菌体的侵染或质粒。同一系统的限制性内切酶和甲基转移酶在DNA上有相同的识别序列,但作用不同,限制性内切酶切割非甲基化的识别序列,甲基转移酶在识别序列上的特异性修饰可防止限制性内切酶的切割。限制-修饰基因常紧密连锁,细菌通过调控两者的表达,使自身DNA首先受到甲基化保护,保护完成后再表达限制酶,而入侵的异源DNA并没有受到保护因而被限制性内切酶降解。即胞内相关的甲基转移酶对与其配对限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰,并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶的切割的特性,保护宿主DNA而降解未被甲基化的外源DNA(GeofferyG.W.,NucleicAcidsRes,2539-2564.1991)。关于限制-修饰系统在原核细胞中表达的研究表明,系统的建立和维持是以甲基转移酶的保护作用为前提。基于DNA分子的结构组成和特性,自然界中主要存在三类DNA甲基转移酶,分别是C5胞嘧啶甲基酶、N4胞嘧啶甲基酶和N6腺 ...
【技术保护点】
一种用于表达限制性内切酶SacI的甲基化保护菌株的筛选方法,其特征在于,(1)甲基转移酶M.AluI的重组表达菌株的建立a、甲基转移酶M.AluI基因的获取甲基转移酶M.AluI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库方法,从菌株
【技术特征摘要】
1.一种用于表达限制性内切酶SacI的甲基化保护菌株的筛选方法,其特征在于,(1)甲基转移酶M.AluI的重组表达菌株的建立a、甲基转移酶M.AluI基因的获取甲基转移酶M.AluI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库方法,从菌株Arthrobacterluteus的基因组中使用甲基转移酶M.AluI基因的特异性引物获得了甲基转移酶M.AluI的基因;b、构建甲基转移酶M.AluI的重组表达菌株将M.AluI基因序列以酶切-连接的方式插入低拷贝表达载体pACYC184质粒中,连接产物转化进入克隆菌株DH5α并涂布于氯霉素抗性平板进行培养;c、甲基化保护菌株的筛选对转化后菌株进行甲基化保护程度的筛选;d、限制性内切酶SacI基因的获取限制酶SacI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库的方法,从菌株Streptomycesachromogenes的基因组中使用限制酶SacI基因的特异性引物获得限制酶SacI的基因;e、构建限制性内切酶SacI的重组表达菌株使用乳糖操纵子表达系统,将SacI基因序列以酶切-连接的方式插入pBAD表达质粒中,连接产物转化进入DH5α表达菌株并涂布于氨苄霉素抗性平板进行培养;通过测序,确认重组质粒的构建成功后转化进入R.SacI特异性保护菌株[pACYC184-M.AluI,ER2566],构建限制酶SacI的重组表达菌株;(2)限制酶SacI的重组表达将测序正确的重组表达质粒pBAD-R.SacI转化感受态细胞[pACYC184-M.AluI,ER2566],涂布于含氨苄霉素和氯霉素抗生素的平板上筛选培养,获得限制酶SacI的重组表达菌株;该菌株经扩大培养后,以阿拉伯糖诱导,获得限制酶SacI的重组蛋白,并确认细菌蛋白粗提液具有限制酶SacI的活性。2.根据权利要求1所述的一种用于表达限制性内切酶SacI的甲基化保护菌株的筛选方法,其特征在于,步骤(1)中,从菌株Arthrobacterluteus的基因组中使用甲基转移酶M.AluI基因的特异性引物PCR扩增获得了甲基转移酶M.AluI的基因;获得甲基转移酶M.AluI基因的方法如下:菌株Arthrobacterluteus平板培养菌落以去离子水重悬后,95˚C温育10min,作为PCR模板;PCR扩增的引物序列基于甲基转移酶M.AluI基因的上游引物5’-端序列及下游引物3’-端反向互补序列进行设计合成;合成的引物序列如下所示:正向引物:5’-CATGCATATGGAGCTCATGGGTGATCAACTG-3’NdeISacI反向引物:5’-TATGCTCGAGTTAGAGCTCTTCTGCTGCGCCCAGTGC-3’XhoISacI这一对引物用于特异性扩增M.AluI基因,同时引入NdeI与XhoI的酶切位点,方便后续酶切-连接以及筛选实验;PCR扩增反应使用KOD-Pure+DNAPolymerase,按照标准PCR反应流程进行,获得了与理论值大小一致的M.AluI基因片段序列1;上述PCR扩增产物通过酶切-连接的方式与pACYC184载体形成重组表达质粒。3.根据权利要求1所述的一种用于表达限制性内切酶SacI的甲基化保护菌株的筛选方法,其特征在于,步骤(1)中,制备M.AluI的pACYC184表达载体按照以下流程进行:pACYC184质粒以LightningTMNdeI及LightningTMXhoI限制酶双酶切后,再以AlkalinePhosphatase(Fast)进行去磷酸化处理,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,并割胶回收线性化的pACYC184载体片段,溶于TEBuffer中;使用KOD-Pure+DNAPolymerase对M.AluI基因进行PCR扩增,对获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,确认获得特异性扩增片段后,用LightningTMNdeI及LightningTMXhoI限制酶双酶切后与线性化的pACYC184载体片段连接,按照摩尔质量比1:3的浓度,经T4DNALigase(Fast)于22°C下反应1h后使用化学转化法转化进入DH5α感受态细胞中;在氯霉素筛选条件下进行细胞培养,获得了M.AluI的重组表达质粒pACYC184-M.AluI;质粒pACYC184-M.AluI序列的正确性经过测序确认。4.根据权利要求1所述的一种用于表达限制性内切酶...
【专利技术属性】
技术研发人员:张坤晓,龚雪梅,韩挺翰,许恒皓,
申请(专利权)人:江苏愚公生命科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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