The invention belongs to the technical field of Melon Wilt Disease Prevention, discloses the cloning and sequence analysis method, a kind of anti Fusarium wilt activity of gene products include: extracting soil microbial genome DNA ectopic lysis; metagenomic Fosmid library was constructed and its quality detection; screening of metagenomic Fosmid expression library, Fosmid activity of cloning; purification and activity identification the material, determine the structure of the active substance, to test the activity of anti Fusarium wilt compounds; screening and transformation of endophytic strains, the gene into transformed strains, by selecting different promoters, different culture medium and fermentation conditions, the establishment of drugs against Fusarium wilt Gene Expression system. The present invention will isolate, screen and transform endophytes as an expression strain, and establish a highly efficient target gene heterologous expression system screened from the library. It lays a solid foundation for the commercialization of the anti - Fusarium wilt drugs.
【技术实现步骤摘要】
一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法
本专利技术属于瓜类枯萎病防治
,尤其涉及一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法。
技术介绍
瓜类枯萎病又称蔓割病、萎凋病,是瓜类生产中主要的土传病害之一,尤以西瓜、黄瓜和甜瓜上的危害最为严重。该病遍及中国、美国、意大利、以色列、日本和印度等几十个国家和地区,我国南北方西瓜种植区都有不同程度发生。尤其是南方热带和亚热带地区,雨量充沛、气候温和,病原菌无越冬现象,造成病菌孢子在土壤中的大量累积,病害发生率极高,重茬地一般发病率在30%以上,严重地块达80%,甚至造成绝产。近些年来瓜类枯萎病害频频发生,并有蔓延趋势,严重影响了瓜类产量和品质,使农民遭受巨大的经济损失。瓜类枯萎病的防治方法主要有农业防治(嫁接和培育抗病品种等)、物理防治、化学防治、生物防治等,目前多以化学药剂防治为主。但由于土传病害中的病原菌掩蔽性较强,化学杀菌剂难以与其直接接触,不能从根本上杀灭病原菌,施用成本高。同时化学药剂广泛使用所带来的环境污染等一系列副作用已日趋凸显,生产使用正逐步受到限制。因此,符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治方法已显得十分重要和迫切。在瓜类枯萎病的生物防治研究中,生防资源虽然丰富,人们也通过室内生物测定的方法,筛选出对枯萎病有拮抗作用的真菌(木霉属真菌)、细菌(假单胞菌等)和放线菌,但是,其温室和大田防治效果不明显,甚至无效果,不能开发成商品化的生物防治药剂应用于大田实际生产中。究其因,生防菌株不能在根围,甚至维管束部定植,而瓜类枯萎病是一类维管束寄生菌,在适宜的温、湿度下萌发出芽管,从根部、根 ...
【技术保护点】
一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法,其特征在于,所述抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法包括:(1)异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA;(2)宏基因组Fosmid文库构建及其质量检测;(3)筛选宏基因组Fosmid表达文库,获得Fosmid活性克隆;(4)活性物质的提纯和鉴定,确定活性物质结构,验证化合物抗瓜类枯萎病的活性;(5)筛选和改造植物内生菌株,将基因转化到改造后的内生菌株,通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件,建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。
【技术特征摘要】
1.一种抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法,其特征在于,所述抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法包括:(1)异位裂解法提取土壤微生物基因组DNA;(2)宏基因组Fosmid文库构建及其质量检测;(3)筛选宏基因组Fosmid表达文库,获得Fosmid活性克隆;(4)活性物质的提纯和鉴定,确定活性物质结构,验证化合物抗瓜类枯萎病的活性;(5)筛选和改造植物内生菌株,将基因转化到改造后的内生菌株,通过选择不同的启动子、不同的培养基和发酵条件,建立抗瓜类枯萎病药物基因的高效表达体系。2.如权利要求1所述的抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法,其特征在于,所述Fosmid文库构建方法包括以下步骤:步骤一,采用PVPP洗涤,去除杂质后,溶菌酶—蛋白酶K—SDS—CTAB裂解法,提取和纯化大片段的土壤微生物基因组DNA,每次提取7个样品,混合后形成海南岛热带雨林特色环境土壤微生物基因组总DNA;经1%的琼脂糖凝胶低电压电泳和脉冲电泳检测,提取的DNA片段大于23kb;步骤二,末端修复宏基因组DNA,胶回收23kb以上的片段,将marker和小样切下,在紫外下用牙签作好标记,将大样在日光灯下比着小样和marker切下所要回收达片段;使用Fosmid文库构建试剂盒中自带的Fast-LinkTMDNA连接酶将回收产物连接到Fosmid载体pCC1FOS上;连接反应在2h内完成;步骤三,连接产物经λ包装提取物包装,EPI300-T1R菌株转染,涂于含12.5μg/mL的氯霉素的LB平板上,37℃,过夜培养。3.如权利要求2所述的抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法,其特征在于,所述步骤三中过夜培养,产生了100板,40,000个Fosmid克隆,挑取其中30,624个克隆,摇菌,保存。4.如权利要求2所述的抗瓜类枯萎病活性产物基因的克隆与序列分析方法,其特征在于,所述Fosmid文库包含21个OTU,以子囊菌和担子菌为主,各占64.7%和15.5%,子囊菌以盘菌为主,占总的47.4%,担子菌中以伞菌为主...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵志祥,严婉荣,肖敏,陈绵才,曾向萍,
申请(专利权)人:海南省农业科学院植物保护研究所,
类型:发明
国别省市:海南,46
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