本发明专利技术涉及一个人睾丸特异表达的基因编码蛋白质的生物学功能，该基因／蛋白质命名为ＨＳＤ－３．８（ＧｅｎＢａｎｋ 注册号 ＡＦ３１１３１２）。内容包括：以ＨＳＤ－３．８蛋白中与生育相关的片段ＨＳＤ－０．７作为“诱饵”蛋白，利用酵母双杂交的方法筛选人卵巢ｃＤＮＡ文库，得到编码人Ｇ蛋白β１亚基羧基端１４４个氨基酸的ｃＤＮＡ片段；免疫组织化学结果显示，Ｇ蛋白β１亚基在大鼠睾丸组织中主要定位于精母细胞和成熟精子细胞顶体中；细胞免疫荧光共定位结果显示，在ＨＥＫ ２９３细胞中，过表达的“诱饵”蛋白和“捕获”蛋白都分布于胞浆中，二者呈现完全共定位；细胞免疫共沉淀结合Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ免疫印迹实验表明ＨＳＤ－０．７在去磷酸化状态下呈现活性并和Ｇβ １相互作用。这些结果提示ＨＳＤ－３．８蛋白不仅参与了精子发生和受精过程，而且影响了各类生精细胞中的信号传导及精卵识别和融合过程，阐明其生理生化功能对了解精子发生及受精过程中的信号传导机制具有重要的意义。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术为一个能够与人G蛋白β1亚基相互作用的人睾丸特异表达基因/蛋白质(命名为HSD-3.8)，涉及生物医学高技术中人睾丸特异表达基因所编码蛋白质的开发与应用领域。
技术介绍
1992年Zhang Meilin等采用能引起精子凝集的不孕妇女血清作为探针筛选人睾丸λgt11表达文库获得一长约0.7kb的cDNA片段，再以该片段作为探针继续筛选人睾丸cDNA文库，从中得到一长为2.4kb的基因片段，命名为HSD-2.4。后利用重叠区扩增基因拼接法获得了该基因的全长，命名为HSD-3.8。HSD-3.8编码蛋白质中的一个片段HSD-0.7的抗体对大鼠具有比较好的抗生育效果，该片段包含HSD-3.8编码蛋白质中靠近羧基端的一个由三个TPR基序构成的TPR区和一个P-loop区，P-loop区能够与GTP或ATP特异结合，有GTPase或ATPase活性。TPR蛋白质家族的成员都含有串联的34个氨基酸组成的TPR基序，但不同蛋白质所含TPR基序的个数从3-16个不等。此蛋白质家族的成员通过TPR基序所形成的特殊构象来介导蛋白质间的相互作用，在细胞周期调控，神经发生，有丝分裂和免疫反应等过程中发挥重要的生物学功能。实验证明HSD-0.7蛋白片段在体外具有GTPase活性，能够特异的结合GTP，此结合具有饱和性。HSD-3.8基因在人睾丸组织中特异表达。目前研究主要集中于探讨HSD-3.8基因/蛋白质在细胞信号传导中的功能，应用酵母双杂交系统，细胞免疫荧光及细胞免疫共沉淀实验发现HSD-0.7蛋白能够与人G蛋白β1亚基相互作用，不仅影响了各类生精细胞中的信号传导，而且对精卵识别和融合过程、受精卵中信号传导通路的激活及基因表达的重新启动都有着极其重要的作用。专利技术目的阐明HSD-3.8基因/蛋白质的生理生化功能不仅对了解精子发生及受精过程中的信号传导机制具有重要的意义，并且为相关疾病的基因诊断、基因治疗及抗生育研究提供可能的目标基因，为相关疾病治疗药物提供潜在的靶向载体。内容与要求应用基因组信息学原理、cDNA文库筛选、DNA序列测定技术、5’-RACE、重叠区扩增基因拼接法、分子克隆、酵母双杂交技术、基因表达与蛋白质纯化技术、抗血清制备、免疫组织化学、Western Blot检测、细胞培养技术、细胞免疫荧光、以及细胞免疫共沉淀技术和激光共聚焦显微技术等，克隆鉴定了与HSD-3.8基因编码蛋白质片段HSD-0.7相互作用的人G蛋白β1亚基羧基端144个氨基酸及全长cDNA，表达纯化了目的蛋白并免疫家兔制备了抗血清，进而进行了免疫组织化学分析；借助细胞培养、细胞免疫荧光及激光共聚焦显微等技术，确定了HSD-0.7蛋白和人G蛋白β1亚基在细胞中的共定位；综合运用细胞培养、细胞免疫共沉淀和Western Blot检测技术初步确定了HSD-3.8基因/蛋白质的生物学功能。该基因/蛋白质达到的技术指标为1.HSD-3.8基因编码蛋白质片段HSD-0.7和人G蛋白β1亚基羧基端144个氨基酸(Gβ1-C144)在酵母系统中能够相互作用。2.人G蛋白β1亚基羧基端144个氨基酸(Gβ1-C144)于大肠杆菌中获得明显表达，经亲和层析纯化后的产物免疫家兔，制备了高滴度抗人G蛋白β1亚基抗体(见图1)。3.G蛋白β1亚基在大鼠睾丸组织中主要表达于精母细胞和成熟精子细胞顶体中(见图2)。4.HSD-0.7蛋白和人G蛋白β1亚基在HEK 293细胞中均可表达，且定位于胞浆中，二者呈现完全共定位(见图3，4)。5.HSD-0.7蛋白在去磷酸化状态下呈现活性并和人G蛋白β1亚基结合(见图5)。6.该基因及其编码蛋白质与各类生精细胞中的信号传导及精卵识别和融合过程等生命现象密切相关。附图说明图1.pET-30a(+)-Gβ1-C144重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的表达及纯化结果1低分子量蛋白质Marker；2诱导的pET-30a(+)/BL21(DE3)菌体蛋白质；3未诱导的pET-30a(+)-Gβ1-C144/BL21(DE3)菌体蛋白质；4诱导的pET-30a(+)-Gβ1-C144/BL21(DE3)菌体蛋白质；5诱导的pET-30a(+)-Gβ1-C144/BL21(DE3)菌体蛋白质裂解液的上清部分；6诱导的pET-30a(+)-Gβ1-C144/BL21(DE3)菌体蛋白质裂解液的包涵体部分；7纯化的His6-tagged-Gβ1亚基羧基端144个氨基酸。图2.免疫组织化学方法检测G蛋白β1亚基在大鼠睾丸组织中的表达左图为对照组，蓝色为苏木精细胞核对照染色；中图和右图为实验组，G蛋白β1亚基主要定位于精母细胞和成熟精子细胞顶体中。左图和中图放大250倍，右图放大500倍。图3.Western Blot检测HSD-0.7蛋白与人G蛋白β1亚基在HEK 293细胞中的表达情况1HA-tagged-HSD-0.7在HEK 293细胞中的表达；2FLAG-tagged-Gβ1在HEK 293细胞中的表达图4.HSD-0.7蛋白与人G蛋白β1亚基在HEK 293细胞中的共定位研究左图中绿色荧光显示HA-tagged-HSD-0.7定位于HEK293细胞胞浆中；中间图中红色荧光显示FLAG-tagged-Gβ1定位于HEK 293细胞胞浆中；右图为前两张图片叠加的结果。两种荧光叠加后呈现黄色，显示HSD-0.7蛋白与人G蛋白β1亚基在HEK 293细胞中完全共定位图5.细胞免疫共沉淀结合Western Blot检测HSD-0.7在去磷酸化状态下和人G蛋白β1亚基结合以ProteinA-Agarose结合兔抗HSD-0.7蛋白抗血清为亲合柱，加入转染了相应真核表达质粒的细胞裂解液进行免疫共沉淀实验。以小鼠抗FLAG单克隆抗体为第一抗体，HRP结合的山羊抗小鼠IgG为第二抗体进行Western Blot检测。组4中用免疫前兔血清代替兔抗HSD-0.7蛋白抗血清。1HA-tagged-HSD-0.7在HEK 293细胞中的表达；2FLAG-tagged-Gβ1在HEK 293细胞中的表达；3对照组FLAG-tagged-Gβ1不能与抗HSD-0.7蛋白抗血清结合；4对照组HA-tagged-HSD-0.7和FLAG-tagged-Gβ1不能与免疫前血清共沉淀；5实验组HA-tagged-HSD-0.7和FLAG-tagged-Gβ1在500μmol/L GDP存在时能够共沉淀；6实验组HA-tagged-HSD-0.7和FLAG-tagged-Gβ1在200μmol/L GTPγs存在时不能共沉淀。实施例1.HSD-3.8蛋白相互作用蛋白质分子的筛选将HSD-0.7 cDNA克隆入pAS2-1质粒，构建诱饵质粒。用500μg人卵巢pACT2文库质粒转化带有pAS2-1-HSD-0.7的酵母菌株Y190，共得到转化子6.06×106，转化子总数大于卵巢文库的独立克隆数，可满足筛库要求。一周后在SD/Trp-Leu-His-+20mmol/L 3-AT培养基上挑取较大的克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测。随后将初步判断为阳性的克隆扩增并抽提酵母质粒，将酵母质粒电转化大肠杆菌HB101进行质粒挽救；将挽救的质粒重新转化Y190本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术涉及一个人睾丸特异表达的、与生育相关的ＨＳＤ－３．８基因编码的蛋白质片段，命名为ＨＳＤ－０．７。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘宁，林雯，缪时英，王琳芳，张晓东，宗书东，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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