动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基技术

动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，包括如下步骤：　　　　（１）纤维素多孔微载体预处理：将纤维素多孔微载体用０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０的磷酸缓冲液（ＰＢＳ）浸泡４ｈ后，倾去ＰＢＳ，再用ＰＢＳ洗涤３次；１２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ后，吸出ＰＢＳ，用ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基洗涤２次后置４℃备用；　　　　（２）细胞接种：搅拌瓶中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到搅拌瓶中培养，培养条件为温度３７．０℃±０．１℃，溶氧２０％－４０％，ｐＨ值７．０±０．０５，转速２０－１００ｒ／ｍｉｎ；　　　　（３）细胞驯化：将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，并将培养基中的血清含量逐渐降到０％，培养条件为温度３７．０℃±０．１℃，溶氧２０％－４０％，ｐＨ值７．０±０．０５，转速２０－１００ｒ／ｍｉｎ，至细胞密度大于５×１０↑［６］细胞／ｍＬ，换液量一般为１／２－１个培养体积；　　　　（４）细胞培养：将细胞悬液转移至反应器中逐级放大培养，使用无泡通气供氧系统，采用批式换液连续培养工艺，定期更新部分微载体，对细胞进行无血清培养。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基，更具体地说是利用多孔微载体将动物细胞固定化，在生物反应器中无血清高密度培养动物细胞，高效表达基因工程产品或其他生物制品的方法以及所使用的培养基，属于细胞工程领域和生物制药领域。
技术介绍
以基因工程和细胞融合技术为标志的现代生物技术在医药工业中形成了一支新的高科技产业——现代生物技术制药工业。据统计，2001年全球现代生物技术药品的销售额超过300亿美元，并且每年以15％-20％的速度增长，而常规药物的增长率为5％-8％。动物细胞大规模培养技术是生物制药产业中的最关键的一个技术平台，目前一半以上获得批准用于临床治疗的生物制品均通过细胞培养技术来生产，而且，随着大分子功能蛋白和人源(化)抗体的开发，基因治疗和细胞治疗的进步，以及组织工程和人造生物器官产品的研发，细胞培养技术将在生物制药产业化领域中发挥更大的作用。用动物细胞大规模培养技术生产的生物制品包括所有治疗性单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素、t-PA、EPO、凝血因子、G-CSF、融合蛋白(如Enbrel)、组织工程产品及其他生物制品。美国FDA批准的很大部分生物制品均是由动物细胞表达生产的。目前主要有细菌(E.coli)、酵母、哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞，即CHO细胞)三种表达系统表达重组蛋白。细菌等原核表达系统繁殖快、易于培养，但表达的蛋白质缺乏转录后的修饰，如缺乏蛋白质限制性酶切位点、二硫键、特殊的糖基化、磷酸化、酰胺化作用以及形成天然蛋白质精确的三维结构的环境等。而许多蛋白的生物活性与转录后的修饰有关，并且原核系统表达的蛋白一般为胞内产物，需要破碎细胞才能提取产物，给产物的分离纯化带来困难，同时还容易受到外源毒素的污染。而真核表达系统如CHO细胞表达的蛋白具有转录后的修饰作用，与人体自身分泌的天然蛋白无论在结构和功能上都非常近似，因而美国FDA倾向在21世纪采用真核表达系统生产蛋白质药物。几乎所有用原核细胞表达的蛋白均可采用真核表达系统生产，反之则不尽然，用动物细胞表达系统表达的蛋白都是胞外分泌的，产物的分离纯化过程非常简单，但是，由于细胞大规模培养技术比较复杂，目前仍处于发展完善阶段，因而许多重组蛋白仍选用原核表达系统生产。2001年全球销售额位列前20位的生物制品，用CHO动物细胞表达的占11种，销售额占总数的65％。由此可见动物细胞表达产品的大规模高效培养技术在生物制药领域中的重要性。技术的发展要求用动物细胞真核表达系统生产的生物制品的比重越来越大。原核表达系统一般用于小分子、结构简单的蛋白生产，蛋白转录后无需修饰，如胰岛素。而真核表达系统主要用于生产大分子、结构复杂的蛋白，并且转录后的修饰对蛋白的生物活性具有重要影响，如组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、促红细胞生成素等(EPO)。生物制品的一个发展趋势是开发分子量较大的功能蛋白和人源抗体、基因治疗产品、治疗用疫苗以及组织工程产品，这些产品一般都是通过动物细胞大规模培养技术来生产的。尤其是治疗用抗体药物的开发是最近5年生物制品研发的重要领域。目前几乎所有的嵌合抗体和人源化抗体都是用CHO细胞表达的，而且检测用鼠源单克隆抗体的生产也可经培养杂交瘤细胞获得。因此，随着生物制药产业的发展，通过动物细胞大规模培养技术生产的生物制品比重将越来越大。动物细胞表达产品生产能力不能满足市场需求。动物细胞培养技术复杂，至今还没有一种公认的比较标准的高效培养技术。由于各制药公司技术保密的需要，在公开发表的论文中很难看到真正应用于生产的工艺和技术。一般来讲，几乎所有的制药公司都采用与细菌发酵相似的批式培养工艺，这种培养工艺技术难度相对较低，但反应器的生产能力也很低，大大限制了动物细胞表达产品的生产和供应。剂量在几百毫克～几克/人/年的药物如Enbrel，生产商已经应用6个12,500L的生物反应器生产，年产量低于10公斤，可见其反应器的生产效率并不高。据Bains&Company预计，今后十年，用哺乳动物细胞生产的生物制品远不能满足市场的需求。为了提高反应器的生产效率，降低运行成本，理想的商业用工业化的动物细胞培养工艺应具有以下特点“大规模、高密度、长时间、高表达”。用较小规模的反应器高效率生产生物制品一直是动物细胞大规模培养技术研究的重点，自1980年代以来，动物细胞大规模培养技术成为生化工程领域最为重要的研究内容之一，但是由于存在以下难点，至今仍没有一种成熟的细胞高效培养技术，这些难点包括(1)动物细胞非常脆弱，如何解决供氧与细胞损伤的矛盾。这是细胞高密度培养的主要限制因素。提高氧传递速率一般会增加混合强度，从而可能对细胞造成损伤。引起细胞机械损伤的因素主要包括机械碰撞、流体剪切、气泡凝聚破裂等，解决的主要方法是添加保护剂如Pluronic F68、血清等；膜包埋培养如中空纤维膜反应器；采用多孔细胞支持物培养，如多孔微载体、烧结陶瓷等；改进反应器结构，使搅拌温和，气泡与细胞隔离，如笼式曝气反应器、无泡通气反应器，气液双升反应器等。(2)如何解决传质混合与过程放大的矛盾。这是实现动物细胞大规模培养的关键。反应器放大培养后应保证具有良好的传质混合性能和温和的细胞生长环境。许多类型反应器如固定床反应器和中空纤维膜反应器在小规模实验中具有很好的细胞培养效果，但都难以用于商业化、大规模生产，主要原因是不能放大培养。目前能够做到放大培养的一般是采用细胞悬浮培养技术。在过去一度认为多孔微载体培养难以逐级放大。(3)如何解决细胞长期连续培养的细胞凋亡问题。这是保持细胞长期高密度培养的关键。细胞体外培养时，诱发细胞凋亡的主要原因是细胞生长的环境条件较恶劣，如营养缺乏，代谢产物的累积，pH和溶氧控制不当，机械搅拌剪切力较大等，尤其在无血清培养基中更易发生。细胞凋亡大大影响了细胞培养时间，从而严重降低反应器的生产能力和利用效率，增加了运行成本和劳动强度。正因如此，近几年来对细胞培养中细胞凋亡的研究正成为细胞培养技术中的一个热门课题。为解决这一问题，许多学者尝试利用基因工程技术改造细胞株，将抑制细胞凋亡的基因bcl-2转染到宿主细胞中，或在细胞培养基中加入昂贵的抑制细胞凋亡的因子，期望抑制或延缓细胞凋亡，延长单个细胞的寿命以延长培养时间，但目前效果并不明显，存在效果不稳定，成本较昂贵，延长时间不长(延长2-3天)等不足，在大规模细胞培养中并未见有应用。(4)如何解决细胞在高密度条件下，由于存在密度效应，单个细胞的表达水平下降问题。如何保持或提高细胞在高密度生长条件下的表达水平，关系到产物的浓度和产量以及培养基的利用率。细胞生命活动赖依存在的内部结构是自然界最复杂的非线性系统之一，简单用传统的化学反应工程原理来设计和运行生物反应器是远不够的，尤其是培养结构更为复杂的动物细胞(细胞表面具有与细胞通讯有关的受体，信息在细胞与环境之间、细胞与细胞之间以及细胞内部的传递直接影响细胞的生长、增殖、代谢及产物表达)。不少文献尝试利用温度的变化、培养液渗透压的变化及其他外部刺激，提高细胞的表达水平。(5)无血清培养基的研究与开发。用含血清培养基生产生物制品有许多不利，如增加培养成本和污染机会，增加纯化难度和成本，增加产品质控指标，因此，大规模生产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡显文，肖成祖，高丽华，李佐虎，陈照烈，刘红，胥照平，张正光，李世崇，王菲，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：