大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于该方法为摇瓶悬浮培养：在３００ｍＬ三角瓶中，加入９０ｍＬ改进的ＭＳ培养基，即在ＭＳ培养基中添加０．２～０．４ｍｇ／Ｌ苄基腺嘌呤（ＢＡ）、１～４ｍｇ／Ｌ奈乙酸（ＮＡＡ）及４０～５０ｇ／Ｌ蔗糖，接种种龄为７ｄ左右的细胞，细胞接种密度为４～８ｇ（干重）／Ｌ，摇床转速为１３０～１６０ｒ／ｍｉｎ，光照强度为５０～１００μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）的荧光灯照射，培养温度为１８℃～２８℃，ｐＨ值为５．８，培养时间为７～９ｄ，获得细胞聚集尺寸５ｍｍ～２０ｍｍ的雪莲细胞。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的大规模高密度培养方法，更具体地说是利用生物工程技术，通过优化雪莲细胞培养的工艺如培养基组成、摇瓶培养的条件及生物反应器中培养的工艺条件，实现稳定高产次级代谢产物黄酮的雪莲细胞的大规模高密度培养，属于生物工程领域和中药现代化领域。
技术介绍
用植物细胞大规模培养方法生产有用的次生物质的技术，已成为继微生物发酵技术和动物细胞培养技术以后的当代生物技术的一个重要组成部分。许多药用植物中含有各种特殊的次级代谢产物如生物碱、甾体类、萜类、黄酮类等物质，具有许多重要的药用价值。但是，(1)许多次生代谢物质难于人工合成；(2)天然资源十分匮乏；(3)人工栽培品种品质下降，由于上述原因，限制了许多名贵中药的临床使用和中成药制造。因此，通过药用植物细胞大量培养来解决中药资源问题，无疑是中药现代化的一个重要研究领域，也是珍稀植物资源的生物技术中的重要内容。 植物细胞大规模培养技术的优点(1)不受地域、气候等自然因素的限制；(2)生长速度快，产品可控性好(对中药现代化有利)；(3)可以探索新的合成路线和获得新的有用物质；(4)有利于保护自然资源；(5)用现代高新生物技术(部分)解决中药资源问题，是中药现代化的一个最好的切入点之一。 国内已经研究过的植物细胞培养物已很多，如麻黄草、高山红景天、黄芪、西洋参、毛地黄、杜仲、三七等等，但是植物细胞大量培养技术明显比微生物和动物细胞培养技术发展缓慢，国内还没有采用植物细胞大量培养技术生产药物已实现产业化的项目，主要因为(1)高产稳定细胞系难获得，大多数培养的植物细胞，其中的次级代谢产物含量较天然低，并且在连续传代过程中细胞系品质会退化，合成目的次级代谢产物的能力会逐渐下降乃至消失；(2)植物细胞培养受剪切力、氧传递、细胞的去分化和凝聚作用影响较大，大规模培养技术难度较大；(3)高产值的产品相对较少。 雪莲花类药材是新兴中药，也是藏医蒙医和维吾尔医等的常用民族药。药理研究证明，雪莲具有抗风湿镇痛、强心、终止妊娠、清除自由基及抗疲劳、解痉、降压和平喘、抑制病毒复制、抑制染色体损伤、促进辐射损伤修复、促创面愈合抗炎等作用。雪莲黄酮类化合物中的jaceosidin和hispidulin具有较强的抑制肝癌细胞生长的作用。用雪莲做原料开发成中成药的有用于治疗风湿性关节炎和顽固性颈椎病等的雪莲注射液、用于治疗偏瘫和脑动脉硬化症的雪莲通脉丸、用于治疗II型糖尿病的雪莲降糖汤、用于烧伤创面治疗的复方雪莲烧伤膏等等。但是由于天然雪莲已经非常稀少，并且是国家明令禁止采挖的保护植物，人工引种也很困难，严重影响了以雪莲为主要原料的药物开发与生产。 我们在2002年申请了专利技术专利“用于大规模植物细胞培养的稳定高产黄酮的雪莲细胞系及其建立方法”(申请号02156868.5，公开号CN1424395A)，获得了一株紫色水母雪莲细胞系TUIP-8(在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日为2002年12月16日，保藏号为CGMCC No.0855，建议的分类命名为水母雪莲紫色细胞系)。该雪莲细胞系具有下列优点(1)黄酮产量大，黄酮含量占细胞干重的12％左右；(2)培养密度高，悬浮培养密度可达22～25g(干重)/L；(3)生长速度快，培养周期短，一般只需7d～10d；(4)稳定性高，可无限传代，连续传代80代(持续2年时间)细胞的生长特性和合成黄酮的能力没有变化；(5)不存在植物细胞培养中较普遍存在的两相培养，即生长相和诱导相培养，细胞在整个培养周期不会受到损伤，因而易实现植物细胞连续培养和收获以提高反应器的生产能力；(6)生长温度范围较宽，在18～30℃范围内生长良好。该专利技术为通过培养雪莲细胞来替代雪莲植物的采挖提供了非常好的物质基础，而本专利技术则是完善该雪莲细胞系的培养工艺，并在生物反应器中实现雪莲细胞的大规模高密度培养。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的大规模高密度培养方法，包括摇瓶悬浮培养和生物反应器培养两种。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的大规模高密度培养方法，该方法为摇瓶悬浮培养在300mL三角瓶中，加入90mL改进的MS培养基，即在MS培养基中添加0.2～0.4mg/L苄基腺嘌呤(BA)、1～4mg/L奈乙酸(NAA)及40～50g/L蔗糖，接种种龄为7d左右的细胞，细胞接种密度为4～8g(干重)/L，摇床转速为130～160r/min，光照强度为50～100μmol/(m2·s)的荧光灯照射，培养温度为18～28℃，pH值为～5.8，培养时间为7-10天，获得细胞聚集尺寸5～20mm的雪莲细胞。 本专利技术作出的创造性贡献在于优化了该细胞系的摇瓶悬浮培养工艺1)接种密度接种密度为4～8g(干重)/L为宜，即传代时一般为一传三到一传六，接种密度低于2g(干重)/L，细胞的生长受到抑制，黄酮的含量会下降。 2)摇床转速摇床转速在培养前期设定为135r/min，当细胞堆积体积大于1/2的培养体积时，将摇床转速提高至150～160r/min。这种培养方法，细胞聚集尺寸较大，黄酮含量高，细胞密度一般在23g(干重)/L。如果摇床转速低于120r/min，细胞密度很低，细胞会由于氧供应不足而死亡。但如果培养前期转速过高，细胞的聚集尺寸较小，影响黄酮合成。 3)光照强度光照强度一般为50～100μmol/(m2·s)的荧光灯照射，低于50μmol/(m2·s)时，黄酮含量大大下降。而高于100μmol/(m2·s)，细胞合成黄酮的能力不会增加。 4)培养温度最适培养温度为25℃，而在18～28℃之间，细胞仍可良好生长，但长期处于30℃以上高温环境，细胞会逐渐褐化死亡，而低于15℃，细胞生长缓慢，但活力良好，一旦置于20～25℃环境中，可以正常生长。 5)细胞聚集尺寸细胞聚集尺寸可以影响含量，细胞聚集尺寸小于1mm，黄酮含量小于8％，聚集尺寸在10～20mm时，黄酮含量一般均在12％左右。TUIP-8细胞系易于聚团，在传代时应尽量挑选尺寸较大的细胞做种子，这样易于保持细胞合成黄酮的能力。 稳定高产黄酮的雪莲细胞系TUIP-8的大规模高密度培养方法，该方法为生物反应器培养采用装配有两个双叶片搅拌桨和直接曝气的气体分布器的7.5LBiostat CT搅拌式生物反应器，装液量为6L，搅拌转速为30～80r/min，培养基为改进的MS培养基，即在MS培养基中添加0.2～0.4mg/L苄基腺嘌呤(BA)、1～4mg/L奈乙酸(NAA)及40～50g/L蔗糖，接种密度为2.5～4g(干重)/L，培养温度为18～28℃，pH控制在4.8～5.6，溶解氧(DO)控制在30％～60％，用两个功率为10瓦的节能日光灯照射培养，培养时间为10-14天，获得细胞聚集尺寸5mm～20mm的雪莲细胞。 7.5L Biostat CT在位灭菌搅拌式生物反应器(德国B.Braun公司)是专门设计用于动物细胞培养的，它的高径比为2∶1，混合较温和，采用无泡通气供氧系统，防止直接通气对动物细胞产生机械损伤，搅拌桨为双叶片透平桨，悬浮能力较强，而产生的剪切力小，该反本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于该方法为摇瓶悬浮培养在300mL三角瓶中，加入90mL改进的MS培养基，即在MS培养基中添加0.2～0.4mg/L苄基腺嘌呤(BA)、1～4mg/L奈乙酸(NAA)及40～50g/L蔗糖，接种种龄为7d左右的细胞，细胞接种密度为4～8g(干重)/L，摇床转速为130～160r/min，光照强度为50～100μmol/(m2·s)的荧光灯照射，培养温度为18℃～28℃，pH值为5.8，培养时间为7～9d，获得细胞聚集尺寸5mm～20mm的雪莲细胞。2.根据权利要求1所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述摇床转速在培养前期设定为135r/min，当细胞堆积体积大于1/2的培养体积时，将摇床转速提高至150～160r/min。3.根据权利要求1所述的大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于所述获得的雪莲细胞以细胞聚集尺寸为5mm～20mm的为最佳，其黄酮含量一般均在12％左右。4.大规模高密度培养雪莲细胞的方法，其特征在于该方法为生物反应器培养采用装配有两个双叶片搅拌桨和直接曝气的气体分布器的7.5L Biostat CT搅拌式生物反应器，装液量为6L，搅拌转速为30～80r/min，培养基为改进的MS培养基，即在MS培养基中添加0.2～0.4mg/L苄基腺嘌呤(BA)、1～4mg/L奈乙酸(NAA)及40～50g/L蔗糖，接种密度为2.5g～4g(干重)/L，培养温度为18℃～28℃，pH控制在4.8～5.6，溶解氧(DO)控制在30...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡显文，高丽华，李佐虎，陆军，陈惠鹏，胥照平，李世崇，张正光，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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