甲基包囊菌及其在选择性拆分制备(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸盐上的应用制造技术

本发明专利技术公开了甲基包囊菌及其在立体选择性拆分制备(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸盐上的应用，对产酶的甲基包囊菌进行细胞固定化后，应用于生物拆分外消旋体(R，S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸乙酯制备高光学纯(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸乙酯，进一步通过水解反应获得(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸盐。本发明专利技术实现转化产率最高可达50.0％以上，立体选择性好，(S)‑α‑乙基‑2‑氧‑1‑吡咯烷乙酸乙酯对映体过量值e.e.s(％)不小于99.5；催化效率高，拆分反应中的外消旋底物浓度最高可达500g/L，反应时间不超过15小时，细胞固定化后重复利用次数不低于35次，易于工业化生产，下游分离简单，环境污染小。

Methyl cyst bacteria and its preparation in selective separation (S) application of alpha ethyl 2 oxygen 1 pyrrolidine acetic acid salt.

The present invention discloses methyl cysts in stereoselective bacteria and resolution preparation (S) application of alpha ethyl 2 oxygen 1 pyrrolidine acetic acid salt, was immobilized on methyl enzyme after encapsulation, application in biological resolution of racemates (R, S) alpha ethyl 2 oxygen 1 pyrrolidine ethyl acetate preparation with high optical purity (S) alpha ethyl 2 oxygen 1 pyrrolidine acetic ester, obtained through hydrolysis reaction (S) alpha ethyl 2 oxygen 1 pyrrolidine acetic acid salt. The invention realizes the conversion yield of up to 50% or more, good stereoselectivity, (S) alpha ethyl 2 oxygen 1 pyrrolidine acetic acid ethyl ester on the enantiomeric excess of e.e.s (%) is not less than 99.5; high catalytic efficiency, separation reaction of racemic substrate concentration up to 500g/L, the reaction time is not more than 15 hours, cell immobilization after repeated use times of not less than 35 times, and is easy for industrialized production, the downstream separation is simple, small environmental pollution.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物催化
，具体地说涉及甲基包囊菌及其在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用。
技术介绍
左乙拉西坦(Levetiracetam)化学名称为(S)-α-乙基-2-氧合-1-乙酰胺吡咯烷，是一种乙酰吡咯烷类化合物的新型抗癫痈药物。该药不仅治疗指数很高，而且药动学特征独特，口服吸收快且安全，生物利用度可达100％，是一种高效、毒副作用小的广谱抗癫痫药，具有极高的开发价值。文献报道，右旋体(R)-α-乙基-2-氧合-1-乙酰胺吡咯烷对于抑制癫痫发作只有轻微或者不明显的药效作用，而左乙拉西坦则是一种安全、高效的抗癫痫药物。左乙拉西坦合成的关键是在反应过程中控制左旋体的光学纯度。(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯经酯水解可获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，该构型的酸是合成左乙拉西坦的关键手性中间体，其结构式如下：单一对映异构体可以由化学、酶法或者化学-酶法等制备。早期文献介绍了左乙拉西坦的制备工艺：将外消旋的左乙拉西坦中间体(±)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸与光学纯的拆分试剂(R)-(+)-α-苯基乙胺或手性膦生成盐，再冷却结晶，将其分离出相应的2个对映体。在传统的对映体拆分过程中存在着能耗高、操作繁琐、收率较低、产物纯度较低、环境污染严重等问题，不利于制药企业节能减排。与化学法相比，生物催化的优点是催化反应通常表现出高的立体选择性和区域选择性，且其催化条件温和，能耗低，效率高。中国专利“耐酪氨酸冢村氏菌及其催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸”(公开号CN101748087A)公开了种耐酪氨酸冢村氏菌，其可用于手性生物催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸中，该方法的产率达到48.1％，但其反应时间过长(12～60h)，反应底物浓度过低(外消旋底物浓度5.2～31.2g/L)，投酶量过大(湿菌体细胞5.2～31.2g/L)，难以实现工业化生产。中国专利申请“微生物催化制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法及菌株”(公开号CN102994429A)公开了一种蜡状芽孢杆菌，以外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯为底物，该菌产生的酯水解酶催化立体选择性水解(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯从而获取S构型产物的方法，该技术中底物最大投量只有100g/L，反应时间长达60h，最高产率为48.9％，应用于实现工业化生产较难。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种新的甲基包囊菌；本专利技术还有一个目的是提供前述甲基包囊菌在立体选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，以适用于工业大规模化生产；本专利技术还有一个目的是提供一种拆分效率高、易于放大生产的细胞固定化技术。技术方案：对于所述的甲基包囊菌cxzy-L013(Methylopilasp.cxzy-L013)，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉大学，430072，保藏日期：2016年9月18日，保藏编号：CCTCCNO.：M2016494。所述甲基包囊菌(Methylopilasp.cxzy-L013)是从浙江临海市杜桥镇华海药业厂区内土壤中经平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，通过检测酶活性，比较立体选择性酯水解酶酶活力大小而获得。该菌落的特征如下：菌落形态：在LB琼脂平板上30℃培养48～72h，菌落呈规则状圆形，边缘整齐，直径0.5～1mm，表面隆起，湿润，有光泽，乳白色；菌体呈短圆杆状，单个分散排列，大小为(0.3～0.4)μm×(1.0～1.2)μm；革兰氏阴性菌；在以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源的培养基上生长缓慢，以甲醇、甲胺盐酸盐、甲酸铵为碳源时生长较快。本专利技术提供了利用前述甲基包囊菌在立体选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，同时也提供了所述甲基包囊菌立体选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐的方法，包括如下步骤：(1)通过细胞固定化方法处理所述甲基包囊菌的菌液，获得固定化菌剂；(2)以(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯为底物，加入一定量的水和所述固定化菌剂进行拆分反应，获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯；(3)然后利用酶水解或碱水解获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐。所述甲基包囊菌的菌液是将甲基包囊菌经斜面培养、种子液培养、接种发酵步骤获得的含有湿菌体不少于50wt％的含酶菌悬液。具体获得步骤如下：斜面培养将Methylopilasp.cxzy-L013甘油管菌株在LB斜面试管划线，30℃培养2～3天；种子液培养斜面菌体接种至种子培养基：30℃培养2～3天，获得种子液；所述种子培养基浓度组成为：MgSO4·7H2O1.0g/L，K2HPO41.8g/L，(NH4)2SO41.0g/L，酵母浸出粉5.0g/L，体积分数为75％的甲醇溶液5.0mL/L(接种前加入)，氨水调节pH7.0。接种发酵种子液接种至发酵罐发酵：接种量为1～10v/v％，发酵温度30℃，氨水控制pH6.5～7.0，通气量：0.5～1vvm，机械搅拌100～1000r/min，发酵过程间歇补加75％的甲醇浓度为5.0mL/L，发酵时长3～4天，当pH不降反升时即可放罐收集菌体；此时OD600≥40，菌体湿重可达70～90g/L。所述发酵培养基浓度组成：NaCl0.5g/L，MgSO4·7H2O3.6g/L，K2HPO41.0g/L，(NH4)2SO41.0g/L，酵母浸出粉6.0g/L，体积分数为75％的甲醇溶液5.0mL/L(接种前加入)。本专利技术在接种培养中培养基的碳源可选用包括但不限于甲醇、甲胺盐酸盐、甲酸铵的任意一种，优选甲醇。如改用葡萄糖、甘油、乙醇作为碳源时，菌体生长非常缓慢。为获得不少于50wt％的含酶菌悬液，将发酵液经高速离心机离心分离后获得含酶湿菌体，按等质量比例将湿菌体与水稀释搅匀，冷藏待用；或直接将发酵液经微滤膜浓缩至含湿菌体质量分数约为50wt％的菌悬液，冷藏待用。所述细胞固定化方法是将甲基包囊菌的菌液溶于缓冲液中，至少加入一种吸附剂和/或一种交联剂，搅拌、抽滤获得固定化菌剂；所述吸附剂选自硅藻土、活性炭的任意一种；所述交联剂选自戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺的任意一种。利用该固定化方法实现的固定化酶的酶活回收率不低于90％，吸附率不低于95％，固定化菌剂可重复利用次数不低于35次。细胞或酶固定化后的酶活回收率计算公式为：A＝W0/(W1-W2)*100％式中：A为固定化酶的酶活回收率，W1为加入游离酶的总活力，W2为固定化后上清液的总酶活力，W0为固定化酶的总酶活力。细胞或酶固定化后的吸附率计算公式为：B＝(W1-W2)/W1*100％式中：B为固定化酶的吸附率，W1为加入游离酶的总活力，W2为固定化后上清液的酶活力。在细胞固定化技术中，包埋法、交联法、吸附法、共价固定法是常用的技术手段，包埋法一般使用海藻酸钠、卡拉胶等对细胞或酶进行包埋，但包埋后的固定化颗粒机械强度较小，在搅拌过程中容易破碎。吸附法操作简便，易实现固定化，条件温和固定化载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲基包囊菌，其分类命名为甲基包囊菌(Methylopila sp.)的cxzy‑L013菌株，2016年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016494。

【技术特征摘要】
1.一种甲基包囊菌，其分类命名为甲基包囊菌(Methylopilasp.)的cxzy-L013菌株，2016年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2016494。2.如权利要求1所述的甲基包囊菌在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用。3.根据权利要求2所述甲基包囊菌在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，其特征在于包括如下3步：(1)通过细胞固定化方法处理甲基包囊菌的菌液，获得固定化菌剂；(2)以(R，S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯为底物，加入一定量的水和所述固定化菌剂进行拆分反应，获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯；(3)然后利用酶水解或碱水解获得(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐。4.根据权利要求3所述甲基包囊菌在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，其特征在于：所述甲基包囊菌的菌液是将甲基包囊菌经斜面培养、种子液培养、接种发酵步骤获得的含有湿菌体不少于50wt％的含酶菌悬液。5.根据权利要求3所述甲基包囊菌在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，其特征在于：所述细胞固定化方法是将甲基包囊菌的菌液溶于缓冲液中，至少加入一种吸附剂和/或一种交联剂，搅拌、抽滤获得固定化菌剂；所述吸附剂选自硅藻土、活性炭的任意一种；所述交联剂选自戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺的任意一种。6.根据权利要求5所述甲基包囊菌在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，其特征在于：所述细胞固定化方法实现的固定化酶的酶活回收率不低于90％，吸附率不低于95％，固定化菌剂可重复利用次数不低于35次。7.根据权利要求6所述甲基包囊菌在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，其特征在于：所述细胞固定化方法是先加入吸附剂，搅拌混合均匀后再加入交联剂。8.根据权利要求7所述甲基包囊菌在选择性拆分分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，其特征在于：加入所述交联剂时还加入了聚乙烯亚胺。9.根据权利要求3所述甲基包囊菌在选择性拆分制备(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸盐上的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖延铭，钱敏帆，严燕兵，华超，龚彬成，谈伟平，
申请(专利权)人：长兴制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33