重组SARS冠状病毒S蛋白的表达和分离纯化制造技术

本发明专利技术提供了重组ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白的表达和分离纯化。ＳＡＲＳ病毒Ｓ蛋白基因被分段和完整地克隆到不同的细菌表达载体进行了表达。Ｓ蛋白基因７５１－１９２５ｂｐ、２００５－３４１０ｂｐ、１－１９２５ｂｐ、３２－３６５９ｂｐ片段及全长１－３７６８ｂｐ　　ＤＮＡ都在大肠杆菌中实现了高效表达，表达量分别占菌体蛋白的３５％、３４％、２４％、１７％和５％，并经亲和层析得到了纯化。用本发明专利技术方法制备的重组Ｓ蛋白可用于临床诊治，疫苗制备和结构生物学研究。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物学领域，更具体地涉及SARS冠状病毒S蛋白的表达和分离纯化。
技术介绍
严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是一种新发现的传染病(Poutanen SM，Low DE，Henry B et al.Identification ofsevere acute respiratory syndrome in Canada，N Engl J Med，www.nejm.org，March 31，2003，10.1056/NEMoa 030634；Lee N，Hui D，Wu A，Chan P，CameronP，Joynt GM，Ahuja A，et al.A major outbreak of severe acute respiratorysyndrome in Hong Kong，N Engl J Med，www.nejm.org，April 7，2003，10.1056/NEJMoa 030685)。研究表明，一种以前未知的冠状病毒为导致该病的病原体。该种冠状病毒被命名为SARS冠状病毒，其全基因组序列也很快被测定。通过对已知冠状病毒的基因组比较，SARS病毒的Spike蛋白(S蛋白)基因得到确认。S蛋白是冠状病毒表面最重要的膜蛋白。它由两个结构域组成，靠近N端的部分形成一个球形结构域，靠近C端部分形成一个穿膜的棒状结构。对已知的冠状病毒的研究已经证明，S蛋白和冠状病毒侵入细胞的过程密切相关，部分冠状病毒S蛋白前体在宿主的细胞质中合成以后会被切成两个部分S1和S2，其中S1形成成熟蛋白的球状部分，S2形成成熟蛋白的棒状部分，包括一个N螺旋，一个M螺旋，一个C螺旋和一个穿膜部分。SARS病毒S蛋白中经生物信息学分析找不到保守的碱性氨基酸剪切位点，可能不剪切，但是S1和S2相应结构应当存在。重组S蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染以及制备疫苗。因此，高效表达和纯化重组SARS病毒S蛋白是诊治SARS的一个重要基础，同时也是研究SARS病毒蛋白结构的必需环节。然而迄今为止对SARS病毒S蛋白的表达仍未获得很大突破，由于S蛋白很大，将S蛋白的编码序列克隆入一些表达载体后，常常发现其表达量很低，难以有效表达。因此，本领域迫切需要开发新的高效表达S蛋白或其片段的技术，以便能够大量生产供科研和制备疫苗所需的S蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种高效表达S蛋白或其片段的方法，以便大量获得S蛋白或其片段。在本专利技术的第一方面，提供了一种制备重组SARS冠状病毒S蛋白或片段的方法，该方法包括步骤(a)提供编码SARS冠状病毒S蛋白或片段的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列含有SEQ ID N01中第751-1925位、2005-3410位、1-1925位、32-3659位或全长1-3768位的核苷酸序列；(b)将步骤(a)中的核苷酸序列插入表达载体；(c)将步骤(b)的表达载体转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞；(d)在表达条件下，培养步骤(c)所述的宿主细胞，从而表达SARS冠状病毒S蛋白或片段；(e)分离纯化步骤(d)的SARS冠状病毒S蛋白或片段。在另一优选例中，所述的表达载体选自pGEX载体。在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌。在另一优选例中，步骤(d)还包括先在补加2％重量的葡萄糖的条件下使当细菌生长至OD为2±0.2。在另一优选例中，所述的表达条件是当细菌生长至OD为2±0.2时，在28±2℃下，用0.2±0.5M IPTG诱导2±0.5小时。在另一优选例中，步骤(e)中获得的SARS冠状病毒S蛋白或片段是与GST的融合蛋白。在另一优选例中，分离纯化步骤(e)包括用亲和层析进行纯化。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的S蛋白片段，所述片段具有SEQ IDN02中251-641位、609-1136位、1-641位、或12-1219位的氨基酸序列。在另一优选例中，所述片段具有SEQ ID NO2中12-1219位的氨基酸序列。在本专利技术的第三方面，提供了一种融合蛋白，它是本专利技术所述的S蛋白片段与GST构成的融合蛋白。在本专利技术的第四方面，提供了一种编码本专利技术上述S蛋白片段的DNA分子。在本专利技术的第五方面，提供了一种含有本专利技术上述DNA分子的表达载体，以及含有所述表达载体的宿主细胞。较佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌。在本专利技术的第六方面，提供了一种疫苗组合物，它含有免疫有效量的本专利技术上述的SARS病毒的S蛋白片段和药学上可接受的载体。较佳地，所述的疫苗组合物还含有佐剂。附图说明图1是S蛋白表达构建物的示意图。图2显示了对SARS病毒S蛋白的各片段在E.coli BL21(DE3)(pLysS)中的表达产物的SDS-PAGE分析结果。其中，诱导条件是在22℃，用0.1mmol/l IPTG诱导3小时。细胞的超声波裂解物上样于10％SDS-PAGE。箭头指出了表达的重组蛋白的位置。各泳道如下泳道1.大范围的蛋白质分子量标准物(New England Biolab#B7709S)；泳道2.E.coli BL21(DE3)(pLysS)超声波裂解物；泳道3.E.coli BL21(DE3)(pLysS)/pS1b超声波裂解物；泳道4.E.coli BL21(DE3)(pLysS)/pS2超声波裂解物；泳道5.E.coli BL21(DE3)(pLysS)/pS1a超声波裂解物；泳道6.E.coli BL21(DE3)(pLysS)/pSΔ超声波裂解物。图3显示了对两种不同的S蛋白表达构建物的SDS-PAGE分析。箭头指出了表达的重组蛋白的位置。诱导条件是28℃，0.1mmol/l IPTG诱导2小时。各泳道如下泳道1，大范围的蛋白质分子量标准物(New England Biolab #87709S)；泳道2，E.coli BL21(DE3)(pLysS)超声波裂解物；泳道3，E.coli BL21(DE3)(pLysS)/pS超声波裂解物；泳道4，E.coli BL21(DE3)(pLysS)/pSNS超声波裂解物。图4显示了对E.coli BL21(DE3)(pLysS)中GST-S融合蛋白表达产物的SDS-PAGE分析结果。箭头指出了表达的重组蛋白的位置。细胞在2×YT培养基培养，然后在28℃用IPTG诱导2小时。其中各泳道如下泳道1大范围的蛋白质分子量标准物(New England Biolab#B7709S)；泳道2BL21(DE3)(pLysS)超声波裂解物的上清液；泳道3BL21(DE3)(pLysS)/pS超声波裂解物的上清液，0.2mM IPTG诱导并且添加2％葡萄糖作为培养基补充剂；泳道4BL21(DE3)(pLysS)/pS超声波裂解物的上清液，0.4mM IPTG诱导；泳道5BL21(DE3)(pLysS)/pS超声波裂解物的上清液，0.7mM IPTG诱导；泳道6BL21(DE3)(pLysS)经超声波裂解后的细胞沉淀；泳道7BL21(DE3)(pLysS)/pS经超声波裂解后的细胞沉淀，0.2mM IPTG诱导并且添加2％葡萄糖作为培养基补充剂；泳道8BL21(DE3)(pLysS)/pS经超声波裂解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备重组ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白或片段的方法，其特征在于，该方法包括步骤：（ａ）提供编码ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白或片段的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列含有ＳＥＱＩＤＮＯ：１中第７５１－１９２５位、２００５－３４１０位、１－ １９２５位、３２－３６５９位或全长１－３７６８位的核苷酸序列；（ｂ）将步骤（ａ）中的核苷酸序列插入表达载体；（ｃ）将步骤（ｂ）的表达载体转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞；（ｄ）在表达条件下，培养步骤（ｃ）所述的宿主细 胞，从而表达ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白或片段；（ｅ）分离纯化步骤（ｄ）的ＳＡＲＳ冠状病毒Ｓ蛋白或片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜卫红，杨晟，俞浩，谢幼华，汪垣，杨勇，张伟，郑华宝，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]