韧皮部特异性表达启动子制造技术

本发明专利技术公开了一种韧皮部特异性表达启动子。具体地说，该启动子来自于与中国番茄黄化曲叶病毒相伴随的卫星分子－ＤＮＡβ。分离的启动子是该ＤＮＡβ分子的β　　Ｃ１　　ＯＲＦ的全长启动子及部分缺失启动子序列。实验表明来自于中国番茄黄化曲叶病毒ＤＮＡβ的β　　Ｃ１　　ＯＲＦ的启动子为韧皮部特异性表达的启动子。本发明专利技术涉及了中国番茄黄化曲叶病毒ＤＮＡβ的β　　Ｃ１　　ＯＲＦ的全长启动子和缺失启动子序列以及含有该β　　Ｃ１　　ＯＲＦ全长启动子和缺失启动子序列的表达盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于产生转基因植物的DNA构建体和方法。具体地说，本专利技术涉及中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF全长启动子序列及其缺失启动子序列的分离。本专利技术也涉及含有连接异源基因的中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF全长启动子和缺失启动子的载体盒的构建。另外，本专利技术也涉及用含有中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1 ORF各种启动子的表达载体进行瞬间表达和稳定表达的方法。
技术介绍
植物基因工程的目的是将外源基因导入受体植物后使其正确而有效地表达。然而这一过程受到很多因子的影响与制约，适合的启动子是外源基因有效表达的关键因素。至今，已有许多不同来源的启动子被用于转化植物细胞。其中一大类是从根癌农杆菌中分离出来的，另一大类为植物本身来源的启动子，由于上述启动子控制的目标基因表达量往往较低，以及与受体植物细胞基因组序列具有一定的同源性，所以在转基因植物中人们通常选用植物病毒启动子。目前在植物基因表达中广泛应用的启动子是组成型启动子，如大多数双子叶转基因植物中使用的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因几乎在转基因植物的所有部位和发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物体内持续、高效的表达往往会对植物的生长发育造成负面影响，有时也会与外源基因特异性表达的研究目的背道而驰。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物生长发育的不利影响，人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。目前已发现的特异性启动子大多数来源于植物基因组，如种子特异性表达启动子PHA-L，韧皮部特异表达启动子RsS1，马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因启动子，与番茄成熟蛋白有关的特异性启动子以及受光调节的RubisoN亚基和叶绿素a/b结合蛋白基因的启动子等。这些特异性启动子的应用实现了外源基因在植物中时空特异性的表达。DNAβ分子是与某些单分体双生病毒伴随的卫星分子。该分子大小约1.3kb，是其辅助病毒基因组的一半左右。DNAβ分子依赖于其辅助病毒进行DNA复制，依赖于宿主植物的转录机制进行转录和表达。其基因组中存在一个高度保守的βC1 ORF，已有研究表明该编码区表达的蛋白是一种致病相关因子，其缺失并不影响DNAβ分子的复制，并且已有实验表明DNAβ分子可以做为表达载体进行遗传操作。本专利技术的开展一方面通过了解决定致病相关蛋白βC1的启动子的活性，可以深入了解该蛋白的表达强度，并且能反映该表达载体的表达效率；另一方面，由于已鉴定的双生病毒的启动子中多数为组织特异性表达的启动子，期望与其伴随的DNAβ分子中的启动子为某种组织特异性表达的启动子，能为植物基因表达提供一些有价值的特异性表达元件。βC1 ORF启动子是影响该病毒卫星载体表达效率的重要因素，该启动子的表达类型也决定了其在转基因中的应用价值。基于此，本专利技术鉴定了βC1 ORF的全长启动子的活性及表达类型以及各缺失启动子的表达活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种韧皮部特异性表达启动子。分离的具有下列组序列的DNA，它包括中国蕃茄黄化曲叶病毒DNAβ的βC1ORF的全长启动子序列和缺失启动子序列(a)全长启动子955的SEQ ID NO1序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；(b)缺失启动子955Δ784的SEQ ID NO2序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；(c)缺失启动子955Δ557的SEQ ID NO3序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；(d)缺失启动子955Δ2.27的SEQ ID NO4序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的DNA序列；(e)65℃下，在含6×SSC、1％SDS、100μg/ml鲑精DNA和5×Denhardt’s的溶液中在20小时内能与上述(a)-(d)中任一项进行杂交的在植物中具有启动子活性的DNA序列。DNA构建体，它包括权利要求1所述的分离的DNA以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因选自于下列组成的基因杀虫剂基因，除草剂抗性基因，抗真菌基因，抗病毒基因，抗微生物基因。含有权利要求2所述的重组DNA的载体，转化的细胞为植物细胞。植物细胞，其中向该植物中导入了权利要求2的重组DNA。利用植物细胞表达有效基因的方法，包括下列步骤(a)以该有效基因可表达的方式将该有效基因连接到权利要求1的分离的DNA的下游以获得重组DNA片段；(b)将该重组DNA片段插入表达载体中；(c)用该载体转化植物细胞；(d)培养该植物细胞。利用植物细胞制备蛋白质的方法，包括下列步骤(a)按照编码所需蛋白质的DNA可以被表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到权利要求1的分离的DNA的下游以获得重组DNA片段；(b)将重组DNA片段插入到载体中；(c)培养该植物细胞；(d)从培养物中回收所需的蛋白质。植物基因组，含有权利要求3，4所述的DNA构建体。表达载体，含有权利要求1的DNA，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体或表达载体，所述载体可以插入有效基因，其中所述有效基因选自于下列组成的基因杀虫剂基因，除草剂抗性基因，抗真菌基因，抗病毒基因，抗微生物基因。本专利技术的优点1.应用本专利技术中的启动子，在植物抗病基因工程中可以实现高效经济的抗病目的。韧皮部是植物维管组织的重要组成部分，由于主要负责植物体内糖等光合产物从叶到其它组织器官的运输，因而成为许多植物病虫害，特别是一些刺吸式昆虫的直接侵害目标。因为韧皮部在植物组织内部，使得一些杀虫剂的药效不显著，而且目前还没有有效的药物能对一些韧皮部发生的病毒病进行防治，所以采用转基因的方法进行病毒病和病虫害的防治就显得尤为必要，而在此过程中韧皮部启动子的作用则更为关键。组织化学染色法结果表明，本专利技术中的全长启动子和最小缺失启动子在转基因植株根、茎、叶的韧皮部组织都能够特异性表达(如图6和7)。此外，组成型表达的强启动子通常会导致外源基因在植株体内的过量表达，从而对植株生长发育产生负面影响。本专利技术中全长启动子活性略强于其它缺失启动子的活性，与强组成型表达启动子CaMV 35S启动子活性相比，全长启动子活性是它的17.77％，所以该启动子驱动的外源基因的表达量并不会对植株的生长发育产生不利影响。综合本专利技术启动子的韧皮部特异性表达和非过量表达外源基因的优点，应用于植物抗病基因工程中能够达到更经济有效的抗病目的。2.应用本专利技术中的启动子，可以消除植物转基因中引起的基因沉默现象。植物基因工程中使用的植物启动子由于与受体植物基因组具有一定的同源性，往往会在寄主植物体内引起基因沉默现象。而本专利技术中的启动子，由于与植物基因组序列没有同源性，所以能够避免基因沉默现象的发生。3.应用本专利技术中的启动子，可以进行植物分化机制研究。在植物细胞分化过程中韧皮部特异性启动子对某些特定基因的表达调节及韧皮部的形成可能起着重要作用，所以研究这类启动子的特殊调节功能将会有助于人们对细胞分化分子基础的了解。附图说明图1是中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ分子的βC1 ORF启动子的系列缺失图。以βC1 ORF的转译起始位点(ATG)为+1位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的具有下列组序列的ＤＮＡ，其特征在于包括中国蕃茄黄化曲叶病毒ＤＮＡβ的βＣ１ＯＲＦ的全长启动子序列和缺失启动子序列：（ａ）全长启动子９５５的ＳＥＱＩＤＮＯ：１序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的ＤＮＡ序列；（ｂ）缺失启动子９５５Δ７８４的ＳＥＱＩＤＮＯ：２序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的ＤＮＡ序列；（ｃ）缺失启动子９５５Δ５５７的ＳＥＱＩＤＮＯ：３序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的ＤＮＡ序列；（ｄ）缺失启动子９５５Δ２２７的ＳＥＱＩＤＮＯ：４序列或其在植物细胞中具有启动子活性的片段的ＤＮＡ序列；（ｅ）６５℃下，在含６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ鲑精ＤＮＡ和５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ的溶液中在２０小时内能与上述（ａ）－（ｄ）中任一项进行杂交的在植物中具有启动子活性的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周雪平，关翠萍，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[]