本发明专利技术公开了一种重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４多肽的制备工艺，为利用基因重组技术进行制备，依以下步骤进行：（１）重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４多肽基因序列的人工合成；（２）人工合成基因序列中引入肠激酶识别序列和便于以后质粒构建的酶切位点；（３）含有重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４多肽基因的表达质粒的构建及鉴定；（４）重组表达质粒导入宿主细胞构成表达系统；（５）外源基因在表达系统内的表达；（６）目的多肽重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４的分离和纯化。本发明专利技术与现有化学合成方法相比，简单，成本低，有利于大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽的制备工艺，特别是利用基因重组技术制备重组Exendin-4多肽的新工艺。
技术介绍
Exendin是一种肽，存在于原产于Arizona和Northern Mexico的爬行动物Gila畸形体和Mexican Beaded Lizard蜥蜴的唾液分泌物中，Exendin-3存在于Heloderma horridum(Mexican Beaded Lizard)的唾液分泌物中，而Exendin-4存在于Heloderma suspectum(Gila畸形体)的唾液分泌物中(Eng，J.等，J.Biol.Chem.，26520259-62，1990；Eng，J.等，J.Biol.Chem.，2677402-05，1992)。Exendin的部分序列与胰高血糖素样肽家族的数个成员相似，与GLP-1NH2的最高同源性为53％(Goke等，J.Biol.Chem.，26819650-55，1993)。GLP-1NH2也称为胰高血糖素原，或者简称为“GLP-1”(本说明书使用后者)，GLP-1具有促胰岛素作用，刺激胰腺β细胞分泌胰岛素。GLP-1抑制胰腺α细胞分泌胰高血糖素(rsov等，Diabetes，42658-61，1993；D’Alessio等，J.Clin.Invest.，97133-38，1996)。GLP-1还可以抑制胃排空(Wettergren A.等，截短的GLP-1(胰高血糖素原78-107-酰胺)抑制人体胃以及胰腺功能，Dig.Dis.Sci.1993年4月；38(4)655-73)，抑制胰高血糖素分泌(CreutzfeldtWOC等，外源性胰高血糖素样肽I(7-36)酰胺对I型糖尿病患者的抑制胰高血糖素和降低空腹高血糖的作用Diabetes Care1996；19(6)580-6)，GLP-1有食欲控制作用(Turton MD等，胰高血糖素样肽1在进食中的中枢调节作用，Nature1996年1月；379(6560)69-72)，还报道GLP-1可恢复老年大鼠老年大鼠胰岛细胞对葡萄糖的敏感性，使其葡萄糖的耐受性恢复到年轻大鼠的水平(Egan JM等，胰高血糖素样肽1恢复老年大鼠的急性期胰岛素释放，Diabetologia 1997年6月，40(增刊1)A130)。GLP-1的体内生物作用时间短是其特征之一，这妨碍它开发为治疗药物。药理学研究证实了Exendin-4和GLP-1之间的相似与不同。据报道Exendin-4作用于分泌胰岛素的βTC1细胞上的GLP-1受体，豚鼠胰腺分散的腺泡细胞和胃壁细胞。还报道所述肽刺激促生长素抑制素的释放和抑制立体胃中的胃泌素释放(Goke等，J.Biol.Chem.26819650-55，1993；Schepp等，Eur.J.Pharmacol.，69183-91，1994；Eissele等，Life Sci.，55629-34，1994)。报道发现Exendin-3和Exendin-4刺激胰腺腺泡细胞产生cAMP和释放淀粉酶(Malhotra，R.等，Regulatory Peptides，41149-56，1992；Raufman等，J.Biol.Chem.26721432-37，1992；Sing等，Regul.Pept.5347-59，1994)。Exendin-4的作用时间较GLP-1明显延长。例如在一个实验中，据报道Exendin-4降低糖尿病小鼠葡萄糖的作用持续数小时，而且根据计量最长长达24小时(Eng.J.，exendin-4对db/db小鼠高血糖的作用延长，Diabetes 1996年5月；45(增刊2)；152A(摘要554))。根据Exendin-3和Exendin-4的促胰岛素活性，提出将其用于治疗糖尿病以及防止高血糖(Eng，美国专利号5,424,286)，该专利公开了Exendin-4与GLP-1促胰岛素分泌的对比实验，与GLP-1相比，产生促胰岛素分泌作用所需的Exendin-4浓度更低，而且Exendin-4在人体内的半衰期更长。目前Exendin-4多肽的生产方法均为化学合成方法，成本较高，这成为其进入药品市场的障碍。
技术实现思路
本专利技术提供了一种简单，成本低，有利于大规模生产的利用基因重组技术制备重组Exendin-4多肽的新工艺。本专利技术利用基因重组技术制备重组Exendin-4多肽的工艺，包括人工合成全序列Exendin-4基因的过程，对载体质粒双酶切及酶切产物纯化连接的重组表达质粒的构建过程，重组体导入宿主大肠杆菌构成原核表达系统，外源基因在表达系统内表达的过程及其表达产物纯化的过程。本专利技术在重组Exendin-4基因的制备过程中采用人工合成基因全序列，其序列如下5’CCA GAT CTG GGT ACC GAT GAC GAT GAC AAG CAT GGC GAA GGTACA TTT ACC AGT GAC TTG TCA AAA CAG ATG GAA GAA GAA GCAGTG CGC TTA TTC ATT GAG TGG CTT AAG AAC GGT GGC CCG AGTAGC GGG GCA CCT CCG CCA TCG TAA TGA ATT CAA GCT TGC G 3’并在序列中引入KpnI、HindIII酶切位点和肠激酶识别序列。与重组体质粒pET32a(+)的Kpn I、HindIII酶切位点一致。重组体所用质粒为pET32a(+)，表达菌株为BL21(DE3)购自Novagen公司，宿主菌株为DH5α购自Promega公司。pET32a(+)全长5900bp，用于在大肠杆菌中克隆外源基因并与硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)以融合蛋白形式表达，其优点为含有强启动子T7启动子，利用IPTG诱导T7聚合酶，显著提高目的基因的表达水平，该质粒含有His-Tag和S-Tag序列，便于表达蛋白的鉴定和纯化。表达菌株BL21(DE3)能高效表达控制于T7启动子和核糖体结合位点的外源基因，它不表达ompT和lon(1)蛋白酶，因此表达产物比较稳定，不会被菌株蛋白酶所降解。表达产物及目的蛋白纯化过程中，方法为四步纯化法，即为(1)Chelating Sepharose F.F亲和层析法初步分离重组Exendin-4及硫氧还蛋白的融合蛋白。(2)酶解融合蛋白用肠激酶酶切步骤1中洗脱下来的融合蛋白。(3)第二次采用Chelating Sepharose F.F和Source 15RPC串连亲和层析法，进一步纯化步骤2所得的酶解液，分离到目的多肽。(4)Q Sepharose H.P离子交换法进一步纯化目的多肽及除去有机试剂。本专利技术与现有化学合成方法相比，简单，成本低，有利于大规模生产。附图说明图1为pET-32a(+)载体物理图谱；图2为pET32a(+)Polylinker区顺序；图3为pET32a(+)-Exendin-4的测序图；图4为pET32a(+)-Exendin-4的测序结果；图5为融合蛋白在转化体内表达的SDS-PAGE电泳分析；图6为30升发酵罐发酵融合蛋白在转化体内表达的SDS-PAGE电泳分析；图7为纯化后的重组Exendin-4多肽的S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４多肽的制备工艺，其特征在于该多肽的基因序列全由人工合成，人工合成基因序列中引入肠激酶识别序列和便于以后质粒构建的酶切位点，并利用基因重组技术进行上游构建、发酵并采用先进纯化工艺进行制备。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩为跃，张仁怀，何凯，杨立明，阳勇，叶学军，闻亚磊，汪猜，
申请(专利权)人：东莞太力生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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