抗菌性多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及自然中不存在的人工合成抗菌性多肽及以该多肽为主成分抗菌剂。该多肽的肽链中含有１单位或２单位以上的１种或２种以上的核定位信号序列ＮＬＳ和／或对该ＮＬＳ实施局部变异的序列，该１单位或２单位以上的ＮＬＳ和／或ＮＬＳ的变异序列中所含氨基酸残基的总数至少为５个，且占构成肽链的全部氨基酸残基数的３０％以上。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含有自然中不存在的形态的独立肽链结构的抗菌性多肽以及以该多肽为主成分的抗菌剂(药用组合物)。
技术介绍
据悉，抗菌性多肽具有很宽的抗菌谱，难以出现抗药性菌，因此，有望用于以人类和动物的细菌感染性疾病的预防和治疗和赋予食材等物品抗菌性为目的的抗菌性多肽的应用。迄今为止，从动植物中已分离出众多抗菌性多肽。例如，在日本特开2000-63400号公报中，就揭示了源自台湾甲虫的抗菌性多肽和以该抗菌性多肽为有效成分的抗菌剂。而日本特开2001-186887号公报则揭示了源自蝎毒的抗菌性多肽和以该抗菌性多肽为有效成分的抗菌剂。而国际公开WO98/51794号公报则揭示了源自防卫素总科之一的人类抗菌性多肽和以该抗菌性多肽为有效成分的抗菌剂。而国际公开WO99/26971号公报中则揭示了源自酪蛋白的抗菌性多肽和以该抗菌性多肽为有效成分的抗菌剂(具体有牙膏、口腔清洁剂等口腔用组合物)。而国际公开WO00/09553号公报则揭示了源自蛙科动物的抗菌性多肽。另外，国际公开WO01/009175号公报揭示了源自植物防卫素的含修饰半胱氨酸的抗菌性多肽。上述各公报中所述的抗菌性多肽，都是在发现自然界所固有的抗菌性多肽后，从中分离出来的抗菌性多肽(或天然抗菌性多肽的氨基酸序列局部变异抗菌性多肽)。因此，只要是以固有的抗菌性多肽而存在的肽为主成分，就难以开发出具有超过自然界固有的肽所起到的抗菌活性和抗菌谱的抗菌性能的抗菌剂。
技术实现思路
本专利技术所揭示的抗菌性多肽是利用不同于已知的抗菌性多肽的工艺开发出的多肽。即，本专利技术提供利用不同于自然界中所存在的抗菌性多肽的肽中所含的氨基酸序列创造出的自然中不存在的人工合成抗菌性多肽。本专利技术还提供上述抗菌性多肽的制造方法。并提供对上述抗菌性多肽编码的多核苷酸序列和含该序列(典型例为基本上由该序列构成)的自然中不存在的人工合成多核苷酸。还有以该抗菌性多肽或对该多肽进行编码的多核苷酸为主成分的抗菌剂(药用组合物)。本专利技术所揭示的抗菌性多肽，其肽链中含1单位或2单位以上的1种或2种以上的核定位信号序列(下称NLS)和/或该NLS序列局部变异的序列。典型例为，上述1单位或2单位以上的NLS和/或NLS变异序列所含氨基酸残基(即构成本专利技术序列的氨基酸残基)的总数至少为5个，且相当于构成肽链的全部氨基酸残基的30％以上，优选为40％以上。NLS是由各生物种和病毒中分离出的核定位信号序列，是原本存在于向细胞内移动的各种肽中的部分序列。而本专利技术人发现独立形态的NLS本身对细菌等有抗菌性，从而实现本专利技术。本专利技术的抗菌性多肽因含有主要构成要素的NLS，从而表现出高抗菌活性。特别是对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有广谱抗菌性。本专利技术的抗菌性多肽优选为，构成肽链的所有氨基酸残基数大于等于5，小于等于100。多肽达到该长度左右，就能表现出稳定的高抗菌活性。且由于肽链较短，易于合成，所以经济效益好。更优选为上述NLS和/或NLS变异序列中所含氨基酸残基总数占构成肽链的全部氨基酸残基数的90％以上(例如100％)的肽。该NLS主体的肽具有极高的抗菌活性。且优选为，构成肽链的全部氨基酸残基数的40％以上为碱性氨基酸(典型例为精氨酸和赖氨酸)。碱性氨基酸残基数的存在比例高，则可达到更高的抗菌活性。而优选之一的抗菌性多肽的特征在于，上述NLS和/或NLS变异序列有2单位以上相接近。一个肽链中存在2单位以上的NLS，则抗菌活性提高。更优选为相邻串接。本专利技术所提供的其它优选抗菌性多肽，含可提高NLS的抗菌活性的其它序列。关于这一点，本专利技术人发现核转出信号序列(下称NES)的现有已知序列有望增大肽的抗菌活性。因此通过本专利技术提供增加NLS和/或NLS的变异序列，在肽链中至少含有1单位NES或对该NES实施部分变异序列的抗菌性多肽。这种方式的抗菌性多肽优选为，特征为NES或NES变异序列的至少1单位配置于接近NLS或NLS变异序列的N末端侧或C末端侧。NES或其变异序列和NLS或其变异序列相邻接配置的多肽(肽链)表现出对细菌，特别是金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的高抗菌活性。且本专利技术还提供以所述抗菌性多肽为主成分的抗菌剂(即药用组合物)。就典型抗菌剂而言，根据用途，除作为主成分的本专利技术的抗菌性多肽之外，还可含有可药用的各种载体(辅料)。本专利技术提供对所述抗菌性多肽编码的核苷酸序列及与该序列互补的核苷酸序列。还提供含这些核苷酸或基本上由这些序列构成的自然中不存在的人工合成多核苷酸(可以DNA片段或RNA片段形式存在)。本专利技术还提供适于制造所述抗菌性多肽的方法。本专利技术所揭示的典型方法包括选择至少1种包括已知是核定位信号序列(NLS)的5氨基酸残基以上的氨基酸序列；设计含1～2单位的所选NLS和/或NLS局部变异序列，且含于该1～2单位的所选NLS和/或NLS局部变异序列中的氨基酸残基总数占全部氨基酸残基数的30％以上、优选为40％的肽链；以及合成具有该设计而成的肽链的抗菌性多肽。NLS局部变异的优选方法，可以举出(a)使天然NLS非碱性氨基酸残基中的至少1个缺失；(b)至少添加1个碱性氨基酸残基至天然NLS；及(c)将NLS中所含非碱性氨基酸残基中的至少1个置换为碱性氨基酸残基。附图说明图1为用丙烯酰胺凝胶电泳对含有无细胞蛋白质合成系统合成的多肽的样品分级的结果照片。图2为用MALDT-TOF MS解析由无细胞蛋白质合成系统合成的多肽时所得分子离子峰的质谱。横轴为质荷比(m/z)，纵轴为相对强度。图3为用MALDT-TOF MS解析由无细胞蛋白质合成系统合成的多肽时所得片段离子峰的质谱。横轴为质荷比(m/z)，纵轴为相对强度。图4为向市售表达载体(pET-41a(+))插入本专利技术的合成多核苷酸的示意图。图5为用丙烯酰胺凝胶电泳对以一道或多道工序精制源自重组大肠杆菌的融合蛋白而得的样品进行分级的结果照片。图6为以一道或多道工序处理源自重组大肠杆菌的融合蛋白所得精制样品的逆相色谱分析结果的质谱。横轴为保留时间(分)，纵轴为峰强(μV)。图7为用MALDT-TOF MS解析以一道或多道工序精制源自重组大肠杆菌的融合蛋白而得的多肽时所得分子离子峰的质谱。横轴为质荷比(m/z)，纵轴为相对强度。图8A为以一道或多道工序处理源自重组大肠杆菌的融合蛋白所得精制样品的逆相色谱分析结果的质谱。横轴为保留时间(分)，纵轴为峰强(μV)。图8B为化学合成多肽样品的逆向色谱分析结果的质谱。横轴为保留时间(分)，纵轴为峰强(μV)。序列表列表序列号83 设计出的抗菌性多肽；序列号84 设计出的抗菌性多肽；序列号85 设计出的抗菌性多肽；序列号86 设计出的抗菌性多肽；序列号87 设计出的抗菌性多肽；序列号88 设计出的抗菌性多肽；序列号89 设计出的抗菌性多肽；序列号90 设计出的抗菌性多肽；序列号91 设计出的抗菌性多肽；序列号92 设计出的抗菌性多肽；序列号93 设计出的抗菌性多肽；序列号94 设计出的抗菌性多肽；序列号95 设计出的抗菌性多肽；序列号96 设计出的抗菌性多肽；序列号97 设计出的抗菌性多肽；序列号98 设计出的抗菌性多肽； 序列号99 设计出的抗菌性多肽；序列号100 设计出的抗菌性多肽；序列号本文档来自技高网...

【技术保护点】
自然中不存在的人工合成抗菌性多肽，其特征在于，肽链中含１单位或２单位以上的１种或２种以上的核定位信号序列ＮＬＳ和／或对所述ＮＬＳ实施局部变异的序列，所述１单位或２单位以上的ＮＬＳ和／或ＮＬＳ变异序列中所含氨基酸残基的总数至少为５个，且占构成肽链的全部氨基酸残基数的３０％以上。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉田彻彦，久米胜嘉，山田喜直，松田阳子，高丽宽纪，
申请(专利权)人：东亚合成株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]