用于转基因青鳉鱼的基因片段制造技术

本发明专利技术涉及一核酸片段，其中包括（１）一青＊鱼β－肌动蛋白启动子；（２）一荧光基因；及（３）腺相关病毒的反向末端重复序列（ＩＴＲ）。本发明专利技术还涉及一质粒，其中包括本发明专利技术的核酸片段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的核酸片段。
技术介绍
观赏用鱼是渔产业之一环并具有全球性市场。因此，利用DNA重组及转基因技术，藉以改变观赏用鱼的表型具有巨大市场价值。转基因鱼研究是利用基因由异源及同源的调节元件所驱动，并由组成或组织特异性表达基因所产生的。调控元件包括抗冻蛋白(antifreezeprotein)、鼠金属硫蛋白(metallothionein)、鸡的δ-结晶(δ-crystalline)、鲤鱼β肌动蛋白(carp β-actin)、鲑鱼组蛋白H3(histone H3)及鲤鱼α球蛋白(α-globin)的基因等等。然而，于转基因鱼中使用这些DNA元件有很大的缺点，包括表达效率低及转基因的镶嵌型(mosaic)表达。将青鳉鱼(mekada)β-肌动蛋白启动子所驱动的lac报导基因显微注射入青鳉鱼卵后，虽然表达很少且具有高度的镶嵌性，但还是会导致lacZ基因短暂的表达，甚至在第一子代也会表达出来。Hamada等人将绿色荧光蛋白与青鳉鱼β-肌动蛋白启动子融合后，显微注射至鱼卵所产生出来的青鳉鱼胚胎的报告中也有类似的结果。(Hamada et al.，1998，Mol Marine Biol Biotechnol 7173-180)。不幸的，传统转基因技术只能产生出释放镶嵌或微弱荧光之转基因鱼。这些转基因鱼荧光仅能于荧光显微镜下以特定波长光源观察。基于此非实用性及种种困难，这些荧光转基因鱼因消费者接受度不佳难以达到商业上的成功。Chi-Yuan Chou等人发表了一个两端连接反向末端重复序列，以增加青鳉鱼体内转基因表达效率的DNA构建质粒。转基因在第0代及之后两代的表达都呈一致性(Chi-Yuan Chou et al.，2001，TransgenicResearch 10303-315)。虽然一种转基因绿色荧光青鳉鱼已有文献发表，而产生其它的荧光基因(如红色荧光蛋白)的不同类转基因鱼之方法及条件皆不相同，且因转基因技术之基因构建，基因表达，基因遗传的策略不同与不确定因素，使得吾人不能轻易由现有技术推得。
技术实现思路
为克服现有技术的转基因荧光鱼缺点，本专利技术彻底并谨慎地在设计中使用概念性突破。一pβ-DsRed2-1-ITR质粒构建体可以经由将青鳉鱼的β-肌动蛋白启动子导入pDsRed2-1-ITR(Clontech)表达质粒产生。适量的该pβ-DsRed2-1-ITR质粒接着以显微注射导入青鳉鱼一细胞时期受精卵细胞质中。注射后之卵细胞以子代是否于全身肌肉表达荧光筛选之。取会表达荧光之子代转基因荧光鱼进行繁殖。虽然现有技术已揭露产生转基因绿色荧光鱼之方法，然而本专利技术之转基因红色荧光鱼之技术与以往显有不同。在质粒构建方面，第一代转基因绿色荧光蛋白质粒，其β-肌动蛋白启动子序列由质粒pOBA-109经限制酶SalI与NcoI作用后，回收的4kb DNA片段与质粒pEGFPITR经限制酶SalI与NcoI作用后，回收的4.7kb DNA片段接合反应作用而成。而第二代转基因红色荧光蛋白质粒，由于可运用之限制酶切割位置较少，因此其接合方式更为复杂困难。首先，其β-肌动蛋白启动子序列由质粒pOBA-109经限制酶EcoRI与NcoI作用后，进行补入突出的5′端的处理，再进一步回收4kb DNA片段，而质粒pDsRedITR经限制酶SalI与BamHI作用后，进行补入突出的5′端的处理，接着进行DNA之5′端脱磷酸作用(Dephosphorylation)，再将4.7kb DNA片段回收。最后将先前所述之含β-肌动蛋白启动子序列的DNA与4.7kb DNA片段经接合反应作用而成。在受精卵显微注射方面，第一代转基因绿色荧光蛋白所选用的毛细管针头孔径为4-5μm，并在注射针管壁做硅化处理，在100倍放大倍率下，将DNA(10ng/ml)注入受精卵的细胞质中，所注射的溶液体积约20-30pl，显微注射后的存活率为85％-90％。在第二代转基因红色荧光蛋白所选用的毛细管针头孔径为1.6-2.5μm，为DNA溶液不会堵塞的最小孔径，所注射的溶液体积约20-30pl在注射管壁不做硅化处理，显微注射后的存活率为90％-95％，约提高5％。由于红色荧光蛋白比率色荧光蛋白表达较为稳定，绿色荧光蛋白在转基因青鳉鱼纯品系的表达上会有偏向黄绿色与橘绿色，在红色荧光蛋白转基因青鳉鱼不会有色差的情形，相形之下红色荧光蛋白对青鳉鱼胚胎发育似乎具有毒性，在所筛选得到的红色荧光青鳉鱼皆为杂合子(heterozygote)。此外，在转基因鱼的孵化上，红色转基因鱼亦有明显较绿色转基因鱼为高的困难度。可见下表 由单次产卵数、平均产卵数、产卵率、坏卵率、孵化率、养成率、平均体长、体重、卵重等，都明显发现纯合子的红TK-1都与绿色TK-1有很大的差异。红TK-1的纯合子的活存率及体长、体重都较绿TK-1明显为低，所以两者间有明显的不同之处。本专利技术中之“青鳉鱼”一词是指来自但非限定于以下之Adrianichthyidae(稻米鱼)诸如Oryzias javanicus，Oryzias latipes，Oryziasnigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryzias matanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryzias melastigma，O.curvinotus，O.celebensis，X.oophorus，及X.saracinorum。优选的青鳉鱼来自但非限定于以下之青鳉科(Oryziinae)品种诸如Oryzias javanicus，Oryziaslatipes，Oryzias nigrimas，Oryzias luzonensis，Oryzias profundicola，Oryziasmatanensis，Oryzias mekongensis，Oryzias minutillus，Oryzias melastigma，O.curvinotus，O.celebensis。最佳的青鳉鱼为Oryzias latipes。本专利技术提供一基因片段，其中包括(1)一青鳉鱼β-肌动蛋白启动子；(2)一荧光基因；及(3)腺相关病毒的反向末端重复序列(ITR)。本专利技术优选的片段为 本专利技术亦提供一质粒，其中该质粒包含本专利技术的基因片段。本专利技术红色荧光基因可由BD Bioscience Clontech购买。在本专利技术实施中，pDsRed2-1当成红色荧光基因之来源。pDsRed2-1编码之DsRed2，其是一DsRed之变体，设计来达到更快速的成熟及降低非特异性聚集。DsRed2包含一系列对应人类密码子优先使用之沉默(silent)碱基对改变供哺乳动物细胞之高度表达。在哺乳动物细胞培养中，当DsRed2结构性表达时，散发红色细胞可于转染后24小时内以荧光显微镜观察。大型不可溶之蛋白聚集通常可在表达DsRed1系统之细菌及哺乳动物细胞中观察到，而表达DsRed2之系统则显着地减少。成熟快速，更稳定的红色荧光蛋白亦可让宿主细胞良好地适应；以DsRed2转染的哺乳类培养细胞未显示明显降低生存能力迹象—在测试过的一些细胞株之中，表达DsR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一基因片段，其包括（１）一青＊鱼β－肌动蛋白启动子；（２）一荧光基因；及（３）腺相关病毒的反向末端重复序列（ＩＴＲ）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：蔡怀桢，
申请(专利权)人：邰港科技股份有限公司，蔡怀桢，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]