MUC1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA与应用制造技术

本发明专利技术公开了ＭＵＣ１粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码ＤＮＡ与应用。其目的是提供ＭＵＣ１粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码ＤＮＡ与其在制备抗肿瘤疫苗和药物中的应用。它是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：１）序列表中的ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１；２）将序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有诱导产生ＭＵＣ１粘蛋白特异性的细胞和体液免疫应答作用的多肽。其编码ＤＮＡ是下述核苷酸序列之一：１）序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：２的ＤＮＡ序列；２）在高严谨条件下可与序列表中ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：２限定的ＤＮＡ序列杂交的核苷酸序列。本发明专利技术可作为活性成份制备成疫苗或药物，起到抑制或清除表达ＭＵＣ１的肿瘤细胞的作用，在医药领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制药和基因工程领域，特别是涉及MUC1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA与其在制备抗肿瘤疫苗和药物中的应用。
技术介绍
肿瘤疫苗是肿瘤生物学治疗的一种手段，其研究已有近百年历史。1991年Boon等首次成功分离了CTL特异性识别的人恶性黑色素瘤抗原MAGE-1，为肿瘤疫苗的研究创立了新的里程碑(Boon等，A gene encoding an antigen recognized bycytolytic T lymphocytes on a human melanoma.Science.1991 Dec13；254(5038)1643-7.)。肿瘤疫苗主要是通过诱导免疫应答来打破机体对肿瘤细胞的免疫耐受而起作用。用作肿瘤疫苗的免疫原主要包括完整的自体或异源性肿瘤细胞、修饰的肿瘤细胞、肿瘤相关抗原、合成糖链抗原、肿瘤抗原肽、肿瘤抗原刺激或转染的树突状细胞、抗独特型抗体及其衍生物、重组病毒或细菌疫苗和核酸疫苗等。目前有多个肿瘤相关抗原被用于肿瘤疫苗的制备。MUC1粘蛋白(以下简称MUC1)是表达于细胞表面的一种高分子量(＞200kD)膜糖蛋白，具有两个基本特征(1)糖链含量占全分子量的50％以上，多以∶型糖苷键与多肽骨架上的糖基化位点连接；(2)多肽骨架中含有20-125个由“HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA’共20个氨基酸残基组成的连续重复序列(variablenumbers of tandem repeats，VNTRs)，所有O型糖基化位点均位于VNTRs中。研究表明，MUC1在多种上皮来源恶性肿瘤(乳腺、胰腺、卵巢、结肠、肺、胃、膀胱、肾脏、食管)中异常表达，主要表现在(1)表达量增高较正常可提高100倍以上；(2)表达部位改变在正常组织中表达于细胞近管腔或腺腔一侧，即呈顶端表达(apical expression)，不与机体免疫系统接触，而在肿瘤中，整个细胞表面均表达，因此，可与免疫系统接触；(3)结构异常主要由于糖基化不全，出现新的糖链及肽表位。自80年代中期，Finn等发现肿瘤患者体内存在可特异识别肿瘤MUC1的CTL细胞以来(Finn等，Specific，major histocompatibility complex-unrestrictedrecognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T cells.Proc NatlAcad Sci U S A.1989 Sep；86(18)7159-63.)，MUC1一直是肿瘤疫苗研究的一个热点分子，用MUC1制备的肿瘤疫苗主要有多肽疫苗、DNA疫苗、树突状细胞疫苗、重组牛痘病毒疫苗、糖链疫苗等，有些疫苗的研究已进入I/II/III期临床。研究表明，MUC1糖链瘤苗在体内主要诱导产生体液免疫应答；MUC1多肽疫苗虽然在动物模型中可诱导较强的CTL应答，但在人体中却主要以体液免疫应答为主，且个别病例出现自身免疫现象。另外，肿瘤患者血循环中含有较高水平的MUC1蛋白，会对注入体内的单抗或瘤苗所诱导产生的抗体起封闭作用，从而大大降低了疗效。因此，制备新的基于MUC1分子的肿瘤疫苗，将有助于解决上述问题。模拟表位(mimotopes)肽疫苗就是其中的一种。模拟表位是指一级结构完全不同的两种物质由于具有相同的空间构象，能与同一抗体或T细胞表面受体的抗原结合区相结合。模拟表位能模拟各种天然抗原的抗原决定簇，目前常用的有多肽模拟蛋白表位和多肽模拟多糖或糖脂表位两种。与天然的表位相比，理论上模拟表位具有如下优势①在天然表位未知的情况下也能获得模拟表位用于预防和治疗；②通过分子改造，能增强模拟表位与MHC分子的结合，更有利于T淋巴细胞的激活；③模拟表位一般为非自身蛋白，有望增强肌体对原表位的免疫应答，或打破对原表位的免疫耐受状态。最近研究表明，用肿瘤抗原的模拟表位作为免疫原可在转基因小鼠及人体内诱导出特异性细胞免疫应答，且未发现自身免疫现象。模拟表位的获得有多种方法，其中基于噬菌体展示技术建立的噬菌体随机肽库是目前最常用的筛选模拟表位的技术之一。其基本思路是将化学合成的随机寡核苷酸序列与噬菌体衣壳蛋白III或VIII基因进行融合，使各种氨基酸排列的短肽表达于不同的噬菌体表面，构建噬菌体随机肽库；通过生物淘洗(biopanning)筛选出能与抗体或淋巴细胞表面受体相结合的短肽配体，测序鉴定插入的编码序列，获得模拟表位的氨基酸序列。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供MUC1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA。本专利技术所提供的MUC1粘蛋白的模拟表位肽，名称为M1，来源于M13噬菌体(PhageM13)，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有诱导MUC1粘蛋白特异性细胞和体液免疫应答作用的多肽。序列表中的SEQ ID №1由12个氨基酸残基组成。本专利技术同时提供编码本专利技术MUC1粘蛋白的模拟表位肽M1的DNA(M1)，它是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID №2由36个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。含有本专利技术DNA的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本专利技术的内容。扩增M1中任一片段的引物对也为本专利技术的内容。本专利技术的另一个目的是提供一种表达上述MUC1粘蛋白的模拟表位肽的方法。本专利技术所提供的表达上述MUC1粘蛋白的模拟表位肽的方法，是将含有上述MUC1粘蛋白的模拟表位肽编码DNA的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到MUC1粘蛋白的模拟表位肽。所述宿主为任一可表达外源基因的原核或真核细胞。所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli BL21、E.coli M15、E.coli JM109或E.coliDH5α等。所述真核细胞可为哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞等。包括COS-7、CHO、BHK-21或Pichia pastoris等。用于构建含有MUC1粘蛋白的模拟表位肽编码DNA的重组表达载体的出发载体可为pET系列、pGEX系列、pMAL系列、pBluescript SK-、pTrx、pTrxFus、pQE-30、pCAT3系列、pβ-gal系列、pcDNA3.1(+/-)、pCMV系列、pCMVScript、pd2EGFP系列、pGL3系列、pIND(SP1)/V5-HisA、pTET-Splice、pVgRXR或pPIC系列等。培养含有本专利技术的MUC1粘蛋白的模拟表位肽编码DNA的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。本专利技术还提供了一种抗肿瘤疫苗和一种抗肿瘤药物。本专利技术所提供的抗肿瘤疫苗和抗肿瘤药物，活性成分均为上述MUC1粘蛋白的模拟表位肽。需要的时候，在上述抗肿瘤药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＭＵＣ１粘蛋白的模拟表位肽，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：１）序列表中的ＳＥＱＩＤ№：１；２）将序列表中ＳＥＱＩＤ№：１的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有诱导产生ＭＵＣ１ 粘蛋白特异性的细胞和体液免疫应答作用的多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张立新，潘进勇，王祥卫，路浩军，李春海，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院附属医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]