一种基于LC‑MS‑MS技术的体内蛋白质营养的评价方法技术

本发明专利技术公开了一种基于LC‑MS‑MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。本发明专利技术评价方法，包含以下步骤：(1)采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；(2)测定蛋白浓度；(3)质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐；(4)LC‑MS‑MS分析；(5)数据库搜索；(6)数据处理。本发明专利技术将蛋白质组学技术用来鉴定不同肠段内容中蛋白质及其消化产物，在此基础上，可以判断出不同肠段内容物蛋白质及其内容物的来源，通过生物信息学分析，可以更深入了解差异蛋白在机体内部的功能，其中与蛋白质消化代谢有关的酶的基因表达可能存在不同，为进一步科学评价蛋白质的消化利用提供科学依据。

An evaluation of in vivo protein nutrition LC MS method based on MS Technology

The invention discloses an in vivo evaluation of protein nutrition LC MS method based on MS technology. The present invention evaluation method comprises the following steps: (1) collected in different intestinal segments contents, extraction and separation of protein components; (2) the determination of protein concentration; (3) before the mass spectra include total protein solution digestion and desalting; (4) analysis of LC MS MS; (5) the database search; (6) data processing. The proteomics technology was used to digest protein and identification of different segments of the content, on this basis, can be judged from different segments of the contents of protein and its contents, through bioinformatics analysis, can be more in-depth understanding of the functional differences in the protein inside the body of the machine, which was related with protein metabolism the enzyme gene may be different, and provide scientific basis for further scientific evaluation using protein digestion.

【技术实现步骤摘要】
一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法
本专利技术属于蛋白质组学
，涉及一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。
技术介绍
目前较为权威的体内蛋白质消化率测定的方法是粪氮平衡实验。其原理是膳食蛋白通过食道进入胃肠道，胃中胃蛋白酶将膳食蛋白进行消化，多肽类进入小肠段(十二指肠、空肠和回肠)由胰蛋白酶和糜蛋白酶作用，最后，少量的微生物细胞、肠内粘膜脱落的粪代谢氮和未被完全消化吸收的蛋白质经过结肠时，以粪便的形式排出体外。摄入氮和粪氮的差值占摄入氮的比例即为表观消化率。尽管会添加5％高消化性酪蛋白后再测定粪代谢氮来校正表观消化率从而得到真消化率，但是这种方法并不能如实的反映体内的蛋白质消化吸收情况。这种体内消化率测定方法操作复杂、时间长，且实验动物对外界环境的要求较高。传统方法只知道摄入氮和排出氮，缺乏对机体内部的消化吸收代谢情况的深入了解，并不能如实的反映机体内的蛋白消化。因此，有必要建立一套能够如实评价膳食蛋白体内消化的新方法。蛋白质组学是应用蛋白质分离、鉴定和定量的技术研究蛋白质组的一门学科，基于质谱的蛋白质组学技术更是广泛应用于生命科学领域。生物质谱技术(MassSpectrometry)是蛋白组学研究中的核心技术，是进行蛋白质鉴定的基本手段，能准确的测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前来讲，液相色谱-质谱联用(LiquidChromatography-MassSpectrometry)技术，已经成为蛋白质高通量分析的主流方法。通常LC与MS是串联的，通过LC分离的肽段在进入MS之前，先经过外加电场使肽段离子化带上电荷。离子化的肽段进入一级MS，确定肽段的精确分子质量、所带电荷数、肽段丰度(即在质谱上的信号强度)等信息后进入二级质谱，通过Mascot数据库搜索、序列比对推断出肽段的氨基酸组成和排列顺序。通过Maxquant软件进行比对数据库，可比对三种来源(宿主、膳食和微生物)的蛋白库，收集对蛋白质在体内消化吸收转化的全部信息。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法，包含以下步骤：(1)采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；(2)测定蛋白浓度；(3)质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐；(4)LC-MS-MS分析：将上一步经消化和脱盐吹干的样品通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并通过使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱法通过纳升离子源进行分析；(5)数据库搜索：使用MaxQuant_1.5.8.3软件分别搜索来自30个单独的鸟枪法LC-MS/MS运行的原始光谱文件；(6)数据处理：包括通过对各个肠段内容物的蛋白进行三方面搜库，具体搜索来源为膳食蛋白，宿主和肠道微生物的蛋白库，对三个来源的蛋白数据进行分析，能够明确知道以下信息：①膳食蛋白在体内的消化情况，在哪个肠段转变成哪种物质，以及鉴定出的蛋白或肽段种类和丰度；②宿主在膳食蛋白的诱导下分泌出了哪些蛋白，参与哪些生物学进程，对机体健康有何种作用；③肠道微生物会对进入大肠的膳食蛋白进行响应，从而代谢蛋白分泌微生物蛋白。其中所述的不同肠段优选十二指肠、空肠、盲肠和/或结肠。作为本专利技术所述的评价方法的优选，采用BCA试剂盒测定不同肠段内容物的蛋白浓度。作为本专利技术所述的评价方法的优选，所述的全蛋白溶液的消化包括以下步骤：(1)将10KD超滤管用超纯水活化；(2)取200μg蛋白量，计算取200μg蛋白的体积为Xml，然后补充Yml8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)至200μl体系(即X+Y＝200μl)到超滤管中，14000×g离心15min；(3)补加200μl8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)，14000×g离心15min；(4)加200μl8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)，往溶液中加入1MDTT5μl，60℃加热60min，冷却至室温，14000×g离心15min；(5)加200μl8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)，加入0.5MIAM20ul，室温暗处孵育45min，14000×g离心15min；(6)加200μl50mMNH4HCO3(pH7.8)，14000×g离心15min，重复一次；(7)换新的超滤管底管，加200μl50mMNH4HCO3(pH7.8)，按Trypsin酶与底物蛋白的量之比在1:50，加入酶液(即加入40μl)，37℃孵育16h(过夜)；(8)孵育结束后，14000×g离心25min，补加50μl，50mMNH4HCO3(pH7.8)，14000×g离心25min，底管内即酶解后肽段，往溶液加甲酸至终浓度为0.2％。(9)将样品转移到1.5ml离心管中，旋转吹干仪吹干即可。作为本专利技术所述的评价方法的优选，所述的全蛋白溶液的脱盐包括以下步骤：(1)将吹干后的样品用50μlB液复溶混匀；(2)用10μlA液活化脱盐柱(ZiptipC18柱)，重复5次；(3)再用10μlB液活化脱盐柱(ZiptipC18柱)，重复10次；(4)吸取10μl(1)中的样品至活化后的柱子中；(5)用10μlB液对脱盐柱进行脱盐；(6)用10μlA液对脱盐柱进行洗脱样品；(7)用Nanodrop微量分光光度计对样品肽段含量进行定量。(8)调平质量：通过选取一个蛋白总量保证每个离心管的蛋白总量一样，根据浓度，吸取一定量的体积到新的离心管。(9)旋转吹干仪吹干备用；其中，A液为含0.2％甲酸的60％乙腈溶液；B液含0.2％甲酸的超纯水。作为本专利技术所述的评价方法的优选，所述的LC-MS-MS分析包括：将脱盐处理吹干的样品离心管用10μl含0.2％甲酸的超纯水进行复溶，复溶后转移到内插管中，标记好名称后进质谱仪上样。通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱纳升离子源进行分析。具体步骤如下，肽样品用0.1％的甲酸酸化，之后通过纳升液质系统的自动进样器将样液注入系统，之后泵入loadingbuffer，流动速度为4μl/min，样品随loadingbuffer自动加载到配备有纳米捕获柱的纳升液质系统；8min后，换用3％到55％的B缓冲液梯度洗脱和分离肽段，缓冲液流速为300nL/min，洗脱时间为112min；换用55％到98％的B缓冲液进一步梯度洗脱剩余的肽段，洗脱时间为5min；分离后的肽段在LTQOrbitrapXL上进行质谱扫描，将碰撞诱导解离的归一化碰撞能量设定为35，并在线性离子阱中以正常分辨率检测所得碎片，锁定质量设为445.120020。其中loadingbuffer为2％乙腈,HPLC级水中的0.1％甲酸；所述的B缓冲液为80％乙腈,HPLC级水中的0.1％甲酸。作为本专利技术所述的评价方法的优选，所述的数据库搜索中使用MaxQuant_1.5.8.3软件的搜索参数设为：作为本专利技术所述的评价方法的优选，所述的膳食蛋白包括:肉蛋白、乳蛋白、植物蛋白；所述的肉蛋白包括源自牛肉、猪肉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于LC‑MS‑MS技术的体内蛋白质营养的评价方法，其特征在于包含以下步骤：(1)采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；(2)测定蛋白浓度；(3)质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐吹干；(4)LC‑MS‑MS分析：将上一步经消化和脱盐吹干的样品通过使用纳米液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并通过使用LTQ‑Orbitrap质谱仪的串联质谱法通过纳升离子源进行分析；(5)数据库搜索：使用MaxQuant_1.5.8.3软件分别搜索来自30个单独的鸟枪法LC‑MS/MS运行的原始光谱文件；(6)数据处理：包括通过对各个肠段内容物的蛋白进行三方面搜库，具体搜索来源为膳食蛋白，宿主和肠道微生物的蛋白库，对三个来源的蛋白数据进行分析，能够明确知道以下信息：①膳食蛋白在体内的消化情况，在哪个肠段转变成哪种物质，以及鉴定出的蛋白或肽段种类和丰度；②宿主在膳食蛋白的诱导下分泌出了哪些蛋白，参与哪些生物学进程，对机体健康有何种作用；③肠道微生物会对进入大肠的膳食蛋白进行响应，从而代谢蛋白分泌微生物蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法，其特征在于包含以下步骤：(1)采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；(2)测定蛋白浓度；(3)质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐吹干；(4)LC-MS-MS分析：将上一步经消化和脱盐吹干的样品通过使用纳米液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并通过使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱法通过纳升离子源进行分析；(5)数据库搜索：使用MaxQuant_1.5.8.3软件分别搜索来自30个单独的鸟枪法LC-MS/MS运行的原始光谱文件；(6)数据处理：包括通过对各个肠段内容物的蛋白进行三方面搜库，具体搜索来源为膳食蛋白，宿主和肠道微生物的蛋白库，对三个来源的蛋白数据进行分析，能够明确知道以下信息：①膳食蛋白在体内的消化情况，在哪个肠段转变成哪种物质，以及鉴定出的蛋白或肽段种类和丰度；②宿主在膳食蛋白的诱导下分泌出了哪些蛋白，参与哪些生物学进程，对机体健康有何种作用；③肠道微生物会对进入大肠的膳食蛋白进行响应，从而代谢蛋白分泌微生物蛋白。2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于所述的不同肠段选自十二指肠、空肠、盲肠和/或结肠。3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于采用BCA试剂盒测定不同肠段内容物的蛋白浓度。4.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于所述的全蛋白溶液的消化包括以下步骤：(1)将10KD超滤管用超纯水活化；(2)取200μg蛋白量，计算取200μg蛋白的体积为Xml，然后补充Yml8M尿素50mMTris-HCl(pH8.0)至200μl体系即X+Y＝200μl到超滤管中，14000×g离心15min；(3)补加200μl8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)，14000×g离心15min；(4)加200μl8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)，往溶液中加入1MDTT5μl，60℃加热60min，冷却至室温，14000×g离心15min；(5)加200μl8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)，加入0.5MIAM20ul，室温暗处孵育45min，14000×g离心15min；(6)加200μl50mMNH4HCO3(pH7.8)，14000×g离心15min，重复一次；(7)换新的超滤管底管，加200μl50mMNH4HCO3(pH7.8)，按Trypsin酶与底物蛋白的量之比在1:50，加入40μl酶液，37℃孵育14-18h；(8)孵育结束后，14000×g离心25min，补加50μl，50mMNH4HCO3(pH7.8)，14000×g离心25min，底管内即酶解后肽段，往溶液加甲酸至终...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春保，王超，周光宏，徐幸莲，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32