一种链霉素的免疫胶体金快速检测试剂板制造技术

本实用新型专利技术涉及一种链霉素的免疫胶体金快速检测试剂板，可用于快速检测蜂蜜、畜禽肉、果蔬、奶制品的链霉素残留。本实用新型专利技术由试剂板塑料外壳以及位于塑料外壳内的试纸条组成，试纸条包括底板以及粘贴在底板上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；胶体金结合垫上含有胶体金‑抗链霉素单克隆抗体的结合物；硝酸纤维素膜上从左到右依次设有相互平行的一条检测线与一条质控线。链霉素检测结果能以肉眼可见的颜色表征出来，进行定性检测，还可用读取装置读取两条线上的具体数值，进行一个半定量检测，适用于工商局、食品加工企业、渔业局对链霉素残留的快速检测。

An immune colloid gold rapid detection kit for streptomycin

【技术实现步骤摘要】
一种链霉素的免疫胶体金快速检测试剂板
本技术属于胶体金免疫层析快速检测领域，具体涉及一种检测链霉素的免疫胶体金快速检测试剂板。
技术介绍
链霉素属于氨基糖苷碱性化合物，是一种广谱抗生素，常作为饲料添加剂、治疗动物疾病的治疗剂、果蔬病害防治剂在畜牧业、养蜂业、水产业、农业上广泛应用，已成为畜牧业发展必不可少的物质基础。但是链霉素在农业、畜牧业等的大量使用，导致动植物体内药物的滞留和蓄积，并会以残留的方式进入人体及生态系统，危害人类健康和环境。食物中链霉素过量残留可能会损害人的前庭神经和耳蜗神经，导致眩晕和听力减退，同时链霉素还具有潜在的致畸作用。因此，针对链霉素在食品中的残留，许多国家和机构都明确规定了最大残留限量。如欧盟2377/90/EEC规定动物源性食品肝脏中链霉素最大残留限量为2.0μg/g，肾脏中为5.0μg/g，肌肉中为0.3μg/g。2002年农业部第235号公告规定，牛奶中链霉素最大残留限量为200μg/kg，禽畜肉肌肉中为600μg/kg，脂肪中为600μg/kg，肝脏中为600μg/kg，肾脏中为1000μg/kg。但是由于链霉素效果好，价格便宜，在农业、畜牧业、水产养殖等过程中仍被大量使用。为了保障人民健康，必需对动植物食品中链霉素进行检测。目前，食品中链霉素残留检测的方法主要有微生物法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫分析法、化学发光法、荧光分光光度法等。微生物法的实验条件、技术要求高，所需时间较长，灵敏度不够高。高效液相色谱法虽然精确度和灵敏度较高，但是样品前处理步骤繁琐，对样品纯度要求高，分析成本也高。酶联免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、精确度高及能大批量测定等优点，但是其中的酶活性易受反应条件的影响，试剂需低温保存，因而实验结果重复性差。
技术实现思路
基于现有的链霉素检测方法存在的缺陷，本技术针对检测要求，提供一种现场快速检测链霉素的免疫胶体金试剂板。本技术试剂板可用于检测链霉素的残留，检测样本可为蜂产品、畜禽肉、水产品、奶制品、果蔬等。本技术试剂板检测限符合要求，重现性好，检测时间短，适合现场快速检测，仪器设备要求成本低。本技术试剂板应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原与金标抗体的显色反应，特异性检测样本中链霉素残留。如果样品溶液中含有链霉素残留，链霉素先与胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中链霉素占据而无法与检测线上链霉素特异性抗原结合；当样品中链霉素的含量超出试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色比质控线浅甚至显无色，判定为阳性。相反，当样品中链霉素含量在试剂板检出限以下或者无残留时，试剂板上的检测线显色与质控线相近或深，判定为阴性。本技术试剂板包含试剂板塑料外壳以及位于塑料外壳内的试纸条，其特征在于：所述试剂板塑料外壳上层依次设有加样孔和观察窗；所述试纸条包括底板以及粘贴在底板上的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述底板上的胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次排列；所述胶体金结合垫上含有胶体金-抗链霉素单克隆抗体的结合物；所述硝酸纤维素膜上从左到右依次设有相互平行的一条检测线与一条质控线。本技术试剂板开设的加样口长度与宽度略小于加样孔正对的样品垫，观察窗的长度与宽度略小于观察窗正对的硝酸纤维素膜，可以防止样品滴加过程中试纸条的移动；另外加样口和观察窗采用开口上端大、下端小的防溢出设计，降低加样过程中的操作误差的产生几率。本技术试剂板的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分首尾均有1～2mm的重叠，该设计能让样品在试纸条上充分与胶体金结合垫、检测线及质控线上的抗原/抗体充分反应。所述胶体金结合垫与硝酸纤维素膜上的检测线和质控线平行。本技术试剂板的样品垫由玻璃纤维、聚酯膜或纤维素滤纸制成，结合合垫由玻璃纤维膜或聚酯纤维素膜制成，吸水垫为滤纸。检测线上喷有链霉素-载体蛋白偶联物，其中载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白。质控线上喷有二抗，其中二抗可为羊抗鼠IgG、兔抗鼠IgG。本技术试剂板具有如下有益效果：(1)特异性强。本技术试剂板对链霉素的交叉反应率为100％，对其他类型抗生素如氯霉素、四环素等的交叉反应率均低于1％，具有高度的专一性。(2)灵敏度高。本技术试剂板对蜂蜜中链霉素检出限为10μg/kg，在同类检测中达到了较优水平。(3)操作简单快速。本技术试剂板将加样后的反应过程进行整合，不仅简化了操作还大大缩短检样时间。滴样后，3-5min即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和质控线颜色的深浅读取结果。(4)成本低，易推广。本技术试剂板生产工艺简单，流程成熟。生产成本低，投资少，收效快。附图说明图1为链霉素免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为塑料外壳，2为加样孔，3为样品垫，4为胶体金结合垫，5为硝酸纤维素膜，6为检测线，7为质控线，8为不干胶，9为底板，10为吸水垫，11为观察窗。图2为链霉素免疫胶体金快速检测试剂板结果读取示意图，其中T为检测线，C为质控线；图2-a中T线颜色比C线深或者一样深，为阴性；图2-b中T线颜色比C线浅或T线消失，为阳性；图2-c中C线消失，为无效。具体实施方式实例1试剂板的制备1.1链霉素-载体蛋白偶联物的制备1.1.1链霉素-肟(SM-肟)的合成取81.3mg链霉素及13.2mg羧甲基羟胺溶于340μL双蒸水，加入1.4mg醋酸钠，室温搅拌反应24h。1.1.2链霉素-牛血清白蛋白(SM-BSA)的合成取170μLSM-肟及100mgEDC溶于20％乙醇溶液中，加入51.6mgBSA(溶于1mL双蒸水)，室温缓慢搅拌反应24h，用0.02MpH7.2的磷酸缓冲液透析两天，分装且4℃保存。1.1.3链霉素-卵清蛋白(SM-OVA)的合成将1.1.2的BSA换成OVA，其它步骤同上，用于小鼠免疫。1.2抗链霉素单克隆抗体的制备选取6～8周龄雌性BALB/c小鼠，取SM-BSA偶联物，20μg/只小鼠，加生理盐水到50μL，与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按每只小鼠100μL进行初免，颈部、皮下多点注射。之后每隔两周加强免疫一次，以不完全佐剂。融合前3d，不加佐剂，腹腔免疫1次。免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按1∶5的比例混合细胞，在50％PEG作用下促进细胞融合，后置于在37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中，以HAT培养基筛选融合的细胞。用间接抑制ELISA进行阳性筛选。腹水McAb的制备：BALB/c小鼠腹腔注射灭菌的0.5mL液体石蜡，7～17d后同法注射单抗细胞1×106～2×106个，10d后抽取腹水，离心去油脂沉淀后即得到小鼠腹水McAb。1.3胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在100mL去离子水中加入1mL1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1mL1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。1.4胶体金-抗链霉素单克隆抗体结合物的制备取已制备好的100mL胶体金溶液，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1.5mg抗链霉素单抗，搅拌20min，再逐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种链霉素的免疫胶体金快速检测试剂板，包含试剂板塑料外壳(1)以及位于塑料外壳内的试纸条，其特征在于：所述试剂板塑料外壳上层依次设有加样孔(2)和观察窗(11)；所述试纸条包括底板(9)以及粘贴在底板上的样品垫(3)、胶体金结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)、吸水垫(10)；所述底板上的胶体金结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)、吸水垫(10)从左至右依次排列；所述胶体金结合垫(4)上含有胶体金‑抗链霉素单克隆抗体的结合物；所述硝酸纤维素膜(5)上从左到右依次设有相互平行的一条检测线(6)与一条质控线(7)；所述加样孔(2)的长度与宽度略小于加样孔正对的样品垫(3)；所述观察窗(11)的长度与宽度略小于观察窗正对的硝酸纤维素膜(5)。

【技术特征摘要】
1.一种链霉素的免疫胶体金快速检测试剂板，包含试剂板塑料外壳(1)以及位于塑料外壳内的试纸条，其特征在于：所述试剂板塑料外壳上层依次设有加样孔(2)和观察窗(11)；所述试纸条包括底板(9)以及粘贴在底板上的样品垫(3)、胶体金结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)、吸水垫(10)；所述底板上的胶体金结合垫(4)、硝酸纤维素膜(5)、吸水垫(10)从左至右依次排列；所述胶体金结合垫(4)上含有胶体金-抗链霉素单克隆抗体的结合物；所述硝酸纤维素膜(5)上从左到右依次设有相互平行的一条检测线(6)与一条质控线(7)；所述加样孔(2)的长度与宽度略小于加样孔正对的样品垫(3)；所述观察窗(11)的长度与宽度略小于观察窗正对的硝酸纤维素膜(5)。2.如权利要求1所述的试剂板，其特征在于加样孔(2)和观察窗(11)为防溢出设计...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟萍，赵芸，柳爱春，陈飞东，王振国，陈思思，胡叶军，
申请(专利权)人：杭州南开日新生物技术有限公司，杭州市农业科学研究院，
类型：新型
国别省市：浙江,33