检测庆大霉素的免疫胶体金试剂板制造技术

本实用新型专利技术涉及一种抗生素残留免疫胶体金试剂板，具体涉及一种检测乳制品中庆大霉素药物残留的免疫胶体金试剂板。该试剂板由上下两块塑料模板和试纸条组成。在试纸条背衬上依次紧密粘贴有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻各部分间有１－２ｍｍ的重叠。胶体金结合垫上包被有抗庆大霉素单克隆抗体与胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有庆大霉素－载体蛋白偶联物和羊抗鼠ＩｇＧ，分别作为检测线和质控线。该试剂可半定量直观检测样品中的庆大霉素残留，整个检测过程需５～１０分钟，无需任何实验设备，利于大规模样本筛选，适合于广大基层部门对乳制品中的庆大霉素进行大规模快速检测。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种检测抗生素残留免疫胶体金试剂板，具体涉及一种检测乳制 品中庆大霉素药物残留的免疫胶体金试剂板。
技术介绍
庆大霉素属于氨基糖苷类抗生素，主要作用于革兰氏阴性细菌，由于其抗菌谱广、 疗效佳、价格低廉而广泛应用于兽医临床和动物饲料添加剂。但是庆大霉素在应用过程中 易产生毒副作用，大剂量不规范使用导致动物性食品中的药物残留超标会对人体健康造成 严重危害，产生肾毒性，耳毒性，肌肉阻滞，过敏反应等一系列毒副作用。我国农业部第235 号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定庆大霉素在乳制品中的残留限量标准为 100ng/mLo目前，对于庆大霉素药物残留的检测方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化 分析法常用的有高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱/质谱联用分析法(LC-MS)，特异性好、 准确率高，是各大检测机构对检测样本进行确证的首选方法。但理化分析法存在对设备、环 境、操作技能等要求，不利于大规模样本筛选，因而不适用于广大基层部门。免疫分析法常 用的有酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫层析法(GICA)，ELISA法检测量大，操作相对简单， 越来越多地被用于动物性食品中抗生素残留的检测，但是整个操作仍需要l_2h，且需用到 特殊仪器设备，具有一定局限性。GICA法灵敏、快速、特异、简便，近年来倍受国内外学者关 注，是今后庆大霉素残留快速检测的发展方向。
技术实现思路
本技术的目的在于提供一种灵敏度高，特异性好，简便快速，生产成本低的庆 大霉素免疫胶体金试剂板。本技术试剂板由上下两块塑料模板、背衬及粘附在背衬上依次紧密相连的样 品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有l_2mm的重 叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样 品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证 样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。胶体金结合垫上包被有抗庆大霉素单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜 上从样品垫到吸水垫方向依次包被有庆大霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为 检测线和质控线。偶联庆大霉素的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血 蓝蛋白(KLH)等。抗庆大霉素单克隆抗体为可以识别庆大霉素的免疫球蛋白或其片段。本技术试剂板的各部分组成成分与功能如下塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液PH值的作用。胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上标记有抗庆大霉素单克隆抗体与胶体金的结合 物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。硝酸纤维素膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。本技术试剂板具有如下有益效果(1)特异性好。本技术试剂板对庆大霉素的交叉反应率为100%，对其他种类 的抗生素包括链霉素、双氢链霉素、新霉素的交叉反应率均低于1 %，可见，本技术试剂 板对庆大霉素有高度专一性。(2)灵敏度高。本技术试剂板对原奶中庆大霉素的检出限为50ppb(ng/mL)， 可以满足我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中对庆大霉素在乳 制品中最高残留限量lOOng/mL的规定要求。(3)操作简单快捷，不依赖任何实验设备，不需任何专业培训。本技术试剂板 将反应所需的大部分原料整合到试剂条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大 大缩短了检样时间，且样品无需特殊处理，5-10分钟内即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜 上的检测线和质控线的颜色深浅读取结果，检测过程无需特殊仪器辅助，普通人员均可操 作，不需要专业培训，极易推广使用。(4)成本低，效益好。本技术试剂板生产工艺成熟、流程简单，生产成本低廉， 投资少，收效快。附图说明图1为庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶 体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC 板。图2为庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控 制区，T为检测区。图3为庆大霉素免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T 为检测区。具体实施方法本技术试剂板的制备包括庆大霉素-BSA偶联物的制备，抗庆大霉素单克隆 抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗庆大霉素单克隆抗体的制备和庆大霉素免 疫胶体金快速检测试剂板的组装。1.庆大霉素与载体蛋白的偶联采用碳二亚胺(EDC · HCl)法将庆大霉素与载体蛋白偶联制备免疫抗原及包被抗 原。称取20mgBSA，加入ImL蒸馏水。另外用ImL蒸馏水溶解20mg EDC · HCl和20mg庆 大霉素，加入到上述溶液中。将溶液混勻后，置于4°C下避光反应12小时(期间可颠倒混 勻)。之后用PBS缓冲液透析4天，期间每间隔8小时换液1次。再将溶液离心，收集上清 液，-20°C下冻存备用。2.抗庆大霉素单克隆抗体的制备取6 8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的庆大霉素-BSA偶联物与等体积 的弗氏完全佐剂乳化，按100 μ g/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全 佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行 将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 10的比例混合，在50% PEG作用下融合， HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37°C、5% C02培养箱中培养。融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初 筛选择10mg/L庆大霉素载体蛋白(OVA)偶联物包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗 后，加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用庆大霉素-OVA包被的 酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2X10_3mol/L庆大霉素溶液等量混合，37°C 感作lh，加入已包被的酶标板中。另外用PBS (0. Olmol/L、pH7. 4)替代庆大霉素溶液作对 照，其余步骤同上。若庆大霉素阻断后的OD值降至对照孔的50%以下，则判为阳性孔。经 2 3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。体外培养将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X 105/mL时停止换液，细胞 全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆 化细胞株IO7个细胞，7天后抽取腹水。3.胶体金溶液的制备胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在IOOmL去离子水中加入ImL 1% 柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，继续煮沸lOmin，冷却后，4°C下保存备用。4.胶体金标记抗庆大霉素单克隆抗体的制备取已制备好的胶体金溶液IOOmL,用0. lmol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅 拌边加入2mg抗庆大霉素单抗，搅本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测庆大霉素药物残留的免疫胶体金试剂板，由上下两块塑料模板和试纸条组成，在试纸条背衬上依次紧密粘贴有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有１－２ｍｍ的重叠，胶体金结合垫上包被有抗庆大霉素单克隆抗体与胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有庆大霉素－载体蛋白偶联物和羊抗鼠ＩｇＧ，分别作为检测线和质控线。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张少恩，桑丽雅，卜令杰，邵伟，
申请(专利权)人：杭州南开日新生物技术有限公司，
类型：实用新型
国别省市：86[中国|杭州]