一种检测血浆中替比夫定含量的方法技术

本发明专利技术属医学检验领域，涉及用液相色谱串联质谱法检测血浆中替比夫定含量的方法。本方法中待测样品不需经氮气吹干，直接乙腈稀释/沉淀蛋白后取上清液进样，经流动相在色谱柱洗脱分离，用串联质谱检测器检测；本方法中采用氘3‑替比夫定(D3‑LdT)为内标，血样加入定量的乙腈沉淀蛋白，在血浆样品处理中灭活病毒后替比夫定无明显降解，保证方法的准确度同时提高操作者的安全性。本方法中采用串联质谱法测定替比夫定和内标的浓度，定量线性范围为10‑10000ng/mL，能满足人体药代动力学研究的要求。本方法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，只需通用型的设备和试剂，分析周期短，成本低，适用于乙肝患者治疗方案的调整以及常规血药浓度的监测。

A method for determination of telbivudine in plasma

The invention belongs to the field of medical inspection, refers to a method of using liquid chromatography tandem mass spectrometry for the determination of telbivudine content in plasma. This method does not need to be measured in the sample dried by nitrogen, direct dilution / acetonitrile protein precipitation supernatant after injection, the mobile phase in the chromatographic column elution with tandem mass spectrometry detection; using the method of 3 deuterium telbivudine (D3 LdT) as the internal standard, blood adding quantitative protein precipitation and the inactivation of virus in plasma samples after treatment of telbivudine has no obvious degradation to ensure the accuracy of the method and improve the safety of the operator. This method used in the determination of the concentration of telbivudine and internal standard quantitative tandem mass spectrometry, the linear range was 10 10000ng/mL, can meet the requirements of human pharmacokinetic dynamics. The method is simple, rapid and sensitive, with only a few sample samples. It only needs general equipment and reagents. The analysis cycle is short and the cost is low. It is suitable for the adjustment of the treatment plan of hepatitis B patients and the monitoring of routine blood concentration.

【技术实现步骤摘要】
一种检测血浆中替比夫定含量的方法
本专利技术属医学检验
，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种用液相色谱串联质谱法检测血浆中替比夫定含量的方法，该液相色谱串联质谱方法适用于检测乙肝患者血浆中替比夫定的含量。
技术介绍
资料显示，乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球范围内普遍的健康问题。据WHO报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌；据06年我国卫生部开展的全国乙型肝炎流行病学调查结果推算，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者约2000万例。替比夫定(Telbivudine，LdT)是人工合成的胸腺嘧啶脱氧核苷的左旋核苷类似物，于2007年2月14日SFDA获批，2007年4月在中国上市。研究报道了替比夫定由于较高的病毒应答率、HBeAg血清学转换率、服药不受进食的影响和动物实验发现无致癌、致畸、致突变作用被美国食品与药品管理局定为妊娠B类药物，从而成为乙肝患者常用的抗HBV药物。研究显示，替比夫定口服吸收后经细胞激酶的作用转化为活性的三磷酸替比夫定，后者可抑制HBVDNA聚合酶的活性，并掺入病毒DNA，导致病毒DNA链合成终止，最终抑制HBV复制；替比夫定口服后迅速被人体吸收，生物利用度40％以上；每日口服替比夫定600mg，在给药后约1小时达血药峰浓度，有长达40至50小时的消除半衰期，5～7天后达稳态，稳态血药浓度约比单剂量给药的血药浓度高50％左右，体内存在轻度蓄积，肾功能受损患者需进行剂量调整。目前文献中关于替比夫定药物浓度的测定方法有LC-MS/MS和HPLC-UV两种，均涉及替比夫定药代动力学的研究，但具体的检测方法及方法学验证尚未见详细报导。另外，从文献中获悉的检测方法分别存在下述若干不足或缺点：(1)操作繁琐，已报导的检测方法通常在样品前处理中，需要在蛋白沉淀后氮气吹干富集再重建以提高灵敏度；(2)替比夫定I/II期临床试验提示，替比夫定600mg/d的最大体液浓度是在0.20～6.84μg/mL之间，而目前报导的检测方法线性范围较窄0.01～5.00μg/mL，鉴于临床合并用药等情况对血药浓度的影响，因此，目前的定量检测范围不能迅速满足临床实际测定需要；(2)HPLC-UV法的定量检测范围为0.1～10.00μg/mL，提高检测上限的同时不能满足人血浆中替比夫定低浓度点的测定要求，(3)HPLC-UV法测定替比夫定及内标的保留时间分别为4.9min和7.7min，分析时间较长，同时对流动相需要量大；(4)精密度较差；日内和日间精密度约在10.6％；(5)由于替比夫定用于治疗HBV、HCV交叉感染的CHB患者，基于保护测定操作者安全的角度，业内推荐在前处理中血浆需加热灭活病毒(58℃，40min)，但该操作步骤存在影响替比夫定的浓度的因素，对此，尚需进一步验证。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种操作安全、样品处理简便、快速、灵敏、选择性好、特异性强的分析检测血浆中替比夫定含量的方法，利于开展替比夫定的体内药代动力学研究、对患者进行剂量调整的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是补充及克服现有技术的缺陷和不足，提供一种操作安全、样品处理简便、快速、灵敏，可供临床批量测定人体血浆中替比夫定血药浓度的方法，尤其涉及一种用液相色谱串联质谱法检测血浆中替比夫定含量的方法。本方法具有操作安全、简便、快速、血浆用量少等特点，可用于临床替比夫定血药浓度监测并作为剂量调整的参考。本专利技术的用液相色谱串联质谱法检测血浆中替比夫定含量的方法，其特征在于，待测样品不需经氮气吹干步骤，直接乙腈稀释/沉淀蛋白后取上清液进样，经流动相在色谱柱洗脱分离，用串联质谱检测器检测；其包括步骤：1)样品预处理取待测样品，加入内标工作液，加入定量的有机溶媒沉淀蛋白，离心后，取上清液于58℃水浴中加热40min，待测；2)样品分离采用通用型液相色谱柱，其填料为高强度硅胶颗粒C18，高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，采用酸性水溶液含0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)的混合液作为流动相，梯度洗脱；梯度洗脱：0-4.0minA:B从(95:5,v/v)到(20:80,v/v)，4.0-4.1minA:B从(20:80,v/v)到(95:5,v/v)，4.1-6.0minA:B(95:5,v/v)；流速:0.4mL/min；3)样品检测采用通用型串联质谱检测器检测替比夫定和内标的峰面积；质谱电离方式：电喷雾离子源；极性：负离子检测；扫描方式：多反应离子检测扫描(MRM)；离子通道选择：LdT：m/z243.10→127.10，D3-LdT：m/z246.10→130.10。本专利技术中，步骤1)的血样处理中采用氘3-替比夫定(D3-LdT)为内标，待测样品经乙腈沉淀蛋白简单预处理后病毒灭活；本专利技术的实施例中，所述的内标为氘3-替比夫定(D3-LdT)，蛋白沉淀剂为乙腈，有机溶媒为乙腈；本专利技术步骤3)的串联质谱法中，采用电喷雾离子源和负离子多反应离子检测扫描，离子通道m/z243.10→127.10检测LdT的峰面积，m/z246.10→130.10检测D3-LdT的峰面积，用标准曲线方程换算成浓度。本专利技术中采用液相色谱串联质谱法检测了临床批量人体血浆样品中替比夫定血药浓度，按下述步骤：1)样品预处理取待测样品100μL于离心管中，加入40μL内标工作液(含胸腺嘧啶磷酸化酶)，混旋10s，于37℃孵育1h以消化可能影响替比夫定测定的内源性胸腺嘧啶，加入200μL乙腈沉淀蛋白，混旋10s，13000rpm离心5min，吸取上清液200μL于58℃加热40min，待测；所述的内标为氘3-替比夫定(D3-Telbivudine，D3-LdT)；血浆样品经加热灭活病毒后，替比夫定无明显降解，保证了方法的准确性；2)样品分离采用通用型的液相色谱柱，其填料为高强度硅胶颗粒C18，高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，流动相由0.1％甲酸水溶液和乙腈组成，梯度洗脱；3)样品检测采用通用型串联质谱检测器检测替比夫定和内标的峰面积；质谱电离方式：电喷雾离子源；极性：正离子检测；扫描方式：多反应离子检测扫描(MRM)；离子通道选择：LdT：m/z243.10→127.10，D3-LdT：m/z246.10→130.10；碰撞气：氮气；仪器参数优选设定为：接口电压：0.25kV；雾化气流速：3.0L/min；加热气流速：8.0L/min；干燥气流速：12.0L/min；接口温度：250℃；DL温度：150℃；加热模块温度：350℃；LdT和D3-LdT的碰撞能量分别为-10.0和-9.0；驻留时间：100ms；4)浓度计算以样品浓度为X轴，LdT峰面积(As)和内标峰面积(Ai)的比值为Y轴，进行加权回归分析，采用标准曲线法推出未知血样的浓度值(在标准曲线范围内)。检测结果显示，本方法快速准确、操作简便、灵敏度高、线性范围广，方法回收率稳定，日间和日内的精密度均小于10％，适用于临床常规监测，适用于乙肝患者的剂量调整。与现有的技术相比，本方法的贡献在于：简化了样品预处理方法，针对测定物进行了实验条件优化：采用结构类似本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测血浆中替比夫定含量的方法，其特征在于，待测样品不需经氮气吹干步骤，直接乙腈稀释/沉淀蛋白后取上清液进样，经流动相在色谱柱洗脱分离，用串联质谱检测器检测；其包括步骤：1)样品预处理取待测样品，加入内标工作液，加入定量的有机溶媒沉淀蛋白，离心后，吸取上清液于58℃水浴中加热40min，待测；2)样品分离采用通用型的液相色谱柱，色谱条件为，其填料为高强度硅胶颗粒C18，高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，采用酸性水溶液含0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)的混合液作为流动相，梯度洗脱；0‑4.0min A:B从(95:5,v/v)到(20:80,v/v)，4.0‑4.1min A:B从(20:80,v/v)到(95:5,v/v)，4.1‑6.0min A:B(95:5,v/v)；流速:0.4mL/min；3)样品检测采用通用型串联质谱检测器检测替比夫定和内标的峰面积，用标准曲线方程换算成浓度；质谱电离方式：电喷雾离子源；极性：负离子检测；扫描方式：多反应离子检测扫描(MRM)；离子通道选择：LdT：m/z 243.10→127.10，D3‑LdT：m/z 246.10→130.10。...

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中替比夫定含量的方法，其特征在于，待测样品不需经氮气吹干步骤，直接乙腈稀释/沉淀蛋白后取上清液进样，经流动相在色谱柱洗脱分离，用串联质谱检测器检测；其包括步骤：1)样品预处理取待测样品，加入内标工作液，加入定量的有机溶媒沉淀蛋白，离心后，吸取上清液于58℃水浴中加热40min，待测；2)样品分离采用通用型的液相色谱柱，色谱条件为，其填料为高强度硅胶颗粒C18，高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，采用酸性水溶液含0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)的混合液作为流动相，梯度洗脱；0-4.0minA:B从(95:5,v/v)到(20:80,v/v)，4.0-4.1minA:B从(20:80,v/v)到(95:5,v/v)，4....

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，陈碧翠，张继明，陈丽，龙建飞，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31