单倍体玉米转化制造技术

公开了用于用位点特异性核酸酶转化雄性来源的单倍体细胞系的方法。在一些实施方案中，雄性来源的单倍体细胞系是玉米小孢子来源的植物组织培养物。此外，本公开提供了用于修饰(例如通过将供体DNA突变或靶向和整合到)单倍体或双单倍体组织基因组的特定基因座的方法。本公开进一步提供了可以从本公开获得从单倍体或双单倍体组织再生全植物的方法，所述组织包含在特定基因组基因座处的突变或在特定基因组基因座内整合的供体DNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本公开一般地涉及植物、植物组织和细胞系、再生植物、和用于在其中引入和/或重排核酸的方法。提供了用于在玉米雄性来源的单倍体细胞中转化(包括位点特异性插入)外源DNA和基因编辑的方法。专利技术背景转基因玉米生产通常涉及通过土壤杆菌(Agrobacterium)共培养或微粒轰击将转基因递送到二倍体体细胞组织，如未成熟合子胚的盾片区中。这些规程通常导致整合的转基因在原代转化体(T0)中“半合”并在T1植物世代中分离。将转基因转移到其它遗传背景中需要通过回交实现渐渗。因而，此类将转基因递送到二倍体体细胞组织或细胞的基因组中并将转基因转移到其它遗传背景中的方法有可能是费力、资源密集且耗时的。使用编码位点特异性核酸酶的多核苷酸将转基因位点特异性地递送到二倍体植物基因组中的一个或多个预定位置(基因组编辑)可能造成另外一系列挑战，这是因为二倍体基因组具有两组相应的同源染色体，这些被编码的位点特异性核酸酶通过切割一对同源染色体中的一条或两条来修饰靶位点。由于切割位点的修复不完全造成的突变并不罕见。此外，由于基因组修复过程是基于模板的，修复过程可以使用外来的供体多核苷酸，也可以使用相应同源染色体上的等位序列作为模板。因此，在二倍体细胞中，相应的同源染色体上的等位序列可能与外来的供体多核苷酸竞争。当这一过程基于相应的同源染色体(而不是供体多核苷酸)而意外地修复了被切割的染色体时，会由此降低靶向转基因整合的效率。已经描述了几种植物转化方法，其导致转基因随机整合到玉米的单倍体基因组中。这些方法包括通过聚乙二醇处理单倍体原生质体(Sukhapindaetal.,1993,PlantCellReports,13:63-68；Jardinaudetal.,1995)，小孢子来源的胚样结构的微粒轰击(Protoplasma，187：138-143)和母本来源的胚的土壤杆菌共培养(美国专利号7,572,635)的转基因的随机整合。然而，仍然没有人探索过玉米的单倍体基因组中的选定位置的稳定的位点特异性(靶向)修饰。因此，对玉米中的单倍体基因组进行稳定和靶向修饰的方法是为人期望的。此外，单倍体细胞中仅有一套染色体，即，对于每个给定基因没有相应的等位序列，外来的供体多核苷酸作为模板容易为同源指导修复所获得，而没有相应同源染色体被当作修复模板的干扰，并且容易揭示突变。许多突变(例如敲除)的表型是隐性的，使得它们在二倍体组织中观察不到，但可以在单倍体中观察到。因此，在雄性来源的单倍体细胞系内借助位点特异性核酸酶进行转化和诱变，随后切割单倍体基因组DNA，并任选地在雄性来源的单倍体细胞系(例如小孢子来源的植物组织培养物的单倍体基因组)内靶向整合供体多核苷酸或靶向修饰特定序列(例如突变)，对用于上述过程的组合物和方法仍然存在需要。因而，本公开提供了用于在雄性来源的单倍体细胞系(例如小孢子来源的植物组织培养物的单倍体基因组)内转化和递送位点特异性核酸酶的新组合物和方法。应用小孢子来源的植物组织培养物转化方法可以提高植物基因组内位点特异性核酸酶整合的效率，从而减少筛选大量转化事件的需要，进一步可降低完成这些类型的实验的相关成本和人员时间。例如，小孢子来源的植物的单倍体基因组的转化部署可以用于将供体DNA整合在特定基因组位点内，并且获得纯合植物，而不需要耗费金钱和人力筛选数万个植物事件。此外，使用雄性单倍体细胞系进行位点特异性核酸酶介导的定向诱变可以为隐性突变的高效鉴定和分离创造条件。专利技术概述本公开部分基于意外发现了一种通过玉米单倍体组织或细胞中的位点特异性诱变或供体转基因整合来稳定且靶向性地修饰单倍体基因组的方法。公开的基因组修饰方法可以与染色体加倍的方法一起使用，使位点特异性突变或转基因在完全固定的遗传背景中即时(instantaneously)变得纯合。此外，本文公开的在单倍体组织或细胞中稳定地修饰基因组的方法可以比其它二倍体组织中的方法更高效。在二倍体组织中，在第一条染色体上的每个基因组序列在第二条染色体上具有相应的等位序列，等位序列在同源性指导的修复作用(homology-directedrepair)中充当模板，同源性指导的修复作用已经进化为可修复第一条染色体中插入的任何突变或转基因。相比之下，单倍体组织或细胞缺失相应的第二条染色体，即它们缺少通过同源性指导的修复作用所用来去除新引入的突变或转基因的修复模板。在一些情况下，外来的供体多核苷酸可以是同源性指导的修复作用最容易得到的模板，这样，有助于确保期望的靶向修饰稳定整合到单倍体基因组中。此外，公开的方法还可用于揭示具有隐性表型的稳定基因组修饰突变，例如敲除和基因失活。在二倍体组织中，隐性表型不明显，而在单倍体组织中，可以观察到导致隐性表型的此类靶向基因组修饰。在一个方面中，本公开涉及用于修饰玉米基因组的方法，所述方法包括：提供玉米小孢子来源的、包含单倍体组织基因组的转化感受态单倍体组织；将编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织；并且确认所述单倍体组织基因组被编码的位点特异性核酸酶所修饰。在一些实施方案中，转化感受态单倍体组织是胚或愈伤组织。在公开的方法中，借助植物转化方法将编码所述位点特异性核酸酶多核苷酸的多核苷酸递送至转化感受态单倍体组织。在某些实施方案中，所述植物转化方法包括下组的任何方法：微粒轰击转化法，土壤杆菌转化法，磷酸钙转化法，聚凝胺(polybrene)转化法，电穿孔转化法，超声转化法，脂质体转化法，显微注射转化法，裸DNA转化法，质粒载体转化法，病毒载体转化法，碳化硅介导的转化法，气溶胶射束转化法(aerosolbeamingtransformationmethod)、和PEG转化法。在任何公开的方法中，位点特异性核酸酶多核苷酸编码选择的核酸酶，包括锌指核酸酶，TALEN核酸酶，大范围核酸酶和CRISPR核酸酶。在一些实施方案中，位点特异性核酸酶优先切割单倍体玉米基因组的基因组DNA靶区域。在具体实施方案中，切割基因组DNA的两条链。在另一个实施方案中，切割基因组DNA的单链。在另外的实施方案中，任何前述方法可以进一步包括递送供体多核苷酸，并将供体多核苷酸稳定整合在修饰的单倍体组织基因组中。在一些实施方案中，每个供体多核苷酸包含至少一个与单倍体组织基因组的基因组DNA靶区域至少85％相同的域。在另外的实施方案中，供体多核苷酸包含与单倍体组织基因组的基因组DNA靶区域中的两个不同序列至少85％相同的两个域。在本文中公开的任何用于修饰单倍体玉米基因组的方法的另外的实施方案中，小孢子来源的转化感受态组织来自具有良种性能特征的玉米。例如，小孢子来源的转化感受态组织可以来自良种玉米系与具有高小孢子培养反应的不同玉米系杂交而得来的杂种玉米。另外，在任何公开的方法中，单倍体组织基因组被修饰的确认包括进行基于PCR的测定法，Southern印迹测定法，Northern印迹测定法，蛋白质表达测定法，Western印迹测定法，ELISA测定法、或下一代测序测定法。来源于任何公开的方法的玉米小孢子的转化感受态单倍体组织可以如下获得：从玉米收获含有小孢子的雄穗；在约4-12℃的温度温育所述雄穗；从所述雄穗分离含有小孢子的花药；在花药培养基中培养花药以生成小孢子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于修饰玉米基因组的方法，所述方法包括：(a)提供包含单倍体组织基因组的玉米小孢子来源的转化感受态单倍体组织；(b)将编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织；并且(c)确认所述单倍体组织基因组被编码的位点特异性核酸酶所修饰。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.28 US 61/985,0421.一种用于修饰玉米基因组的方法，所述方法包括：(a)提供包含单倍体组织基因组的玉米小孢子来源的转化感受态单倍体组织；(b)将编码位点特异性核酸酶的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织；并且(c)确认所述单倍体组织基因组被编码的位点特异性核酸酶所修饰。2.权利要求1的方法，其中所述转化感受态单倍体组织是胚或愈伤组织。3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括通过植物转化方法将编码所述位点特异性核酸酶多核苷酸的多核苷酸递送至所述转化感受态单倍体组织，所述植物转化方法选自下组：微粒轰击转化法、土壤杆菌转化法、磷酸钙转化法、聚凝胺转化法、电穿孔转化法、超声转化法、脂质体转化法、显微注射转化法、裸DNA转化法、质粒载体转化法、病毒载体转化法、碳化硅介导的转化法、气溶胶射束转化法和PEG转化法。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述位点特异性核酸酶多核苷酸编码选自下组的核酸酶：锌指核酸酶、TALEN核酸酶、大范围核酸酶和CRISPR核酸酶。5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述方法进一步包括(b)递送供体多核苷酸，并将所述供体多核苷酸稳定整合在修饰的单倍体组织基因组中。6.权利要求5的方法，其中所述供体多核苷酸包含一个或两个域，并且每个域与所述单倍体组织基因组的基因组DNA靶区域中的序列至少85％相同。7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述小孢子来源的转化感受态组织来自具有良种性能特征的玉米。8.权利要求7的方法，其中所述小孢子来源的转化感受态组织来自良种玉米系与具有高小孢子培养反应的不同玉米系杂交而得来的杂种玉米。9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述方法包括通过实施基于PCR的测定法、Southern印迹测定法、Northern印迹测定法、蛋白质表达测定法、Western印迹测定法、ELISA测定法、或下一代测序测定法来确认所述单倍体组织基因组被修饰。10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述方法还包括：(d)用染色体加倍剂处理所述包含修饰的单倍体组织基因组的单倍体组织；(e)生成包含修饰的双单倍体玉米基因组的双单倍体玉米组织；并且(f)将所述双单倍体玉米组织再生为包含纯合的修饰的双单倍体玉米基因组的双单倍体玉米植物。11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述小孢子来源的转化感受态单倍体组织是通过包括：(i)从玉米收获含有小孢子的雄穗；(ii)在约4-12℃的温度温育所述雄穗；(iii)从所述雄穗分离含有小孢子的花药；(iv)在花药培养基中培养花药以生成小孢子来源的胚；并且(v)在愈伤组织培养基中培养所述小孢子来源的胚，从而生成小孢子来源的转化感受态单倍体组织的方法生成的。12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述方法包括(b...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·F·佩达利诺，T·L·斯特兰奇，J·P·塞缪尔，R·C·布卢，M·A·辛普森，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US