一种防止植物愈伤组织褐化现象产生的方法技术

本发明专利技术公开一种防止植物愈伤组织褐化现象产生的方法。主要通过在继代培养基中添加外源多胺精胺Ｓｐｍ或亚精胺Ｓｐｄ，并保持黑暗培养；同时，在愈伤组织继代培养过程，每隔５～１０天，将培养容器内气态物质与无菌空气进行充分气体交换后，封闭培养容器，继续在原培养基中培养，继代周期为２０～３０天，能有效地防止愈伤组织褐化现象的产生，甚至完全消除褐化现象。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。属于生物

技术介绍
褐化是植物组织培养中常见的现象，影响植物组织培养及植株再生成功与否的关键因素之一。目前已有很多植物在组织培养中发现褐化现象。褐化主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养时也时常发生。许多植物，如暖季型草坪草在合适的培养条件下可以比较容易获得愈伤组织，但在继代培养过程同样愈伤组织极易发生褐化、变黑，以至完全丧失活力，直接影响胚性愈伤组织诱导及植株再生。导致褐化的因素很多，褐化机理也非常复杂，目前还没有统一的机理阐述。近几年国内外在褐化产生的影响因素、褐变产生的机理及其防治措施等方面进行了系统的研究，取得了一定的成果。研究主要针对外植体的褐化。一般认为，褐化是由于多酚氧化酶(PPO)被氧化成醌类物质，并抑制许多酶的活性，从而影响培养材料的正常生长，甚至导致培养物死亡。影响褐化的主要因素是植物的种类及基因型、外植体的生长部位及生理状态、培养基的成分及培养条件等。根据产生褐化现象的影响因素，目前采取的主要措施有(1)选择适当的外植体。通常选择生长旺盛的，分化能力强的部分作为外植体材料，在进行组织培养过程不易产生褐变。(2)对培养材料进行预处理。即对外植体进行高温或低温处理后，接种到仅含碳源的固体或液体培养基预培养一段时间后，再进行一系列诱导培养。(3)选择适宜的培养基和培养条件。通过调整培养基中的无机盐成分、蔗糖浓度、植物生长调节剂浓度水平与组合，结合改变培养温度、光照及pH值等，使外植体保持较强的分生能力有减轻褐化程度。(4)在培养基中加入抑制剂和吸附剂。如Vc(抗坏血酸)通过使多酚氧化酶失活阻止酚类物质氧化及其在酶催化下消耗溶解氧，使酚类物质无法氧化，可减轻外植体的褐化；具吸附作用的活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP对防止褐化也有一定的效果。此外，硫脲、氯化钾等物质在防止褐化研究中也有应用。(5)缩短继代时间，或间隔1～2d连续将外植体转移至新鲜培养基，可以减轻褐化。(6)如陈振华专利(专利号1468508)说明中利用中繁体，对防止一些植物材料褐化有明显效果。如将蝴蝶兰或卡特兰等外植体接种到培养过无褐化现象的天南星科花烛属植物材料的培养基中预培养5～7d，可有效减轻褐化等。但现有技术主要是针对外植体褐化而采取的措施，且只能相对地减轻某些植物组织培养中的褐化程度，并不能有效地解决褐化问题。目前关于能有效防止愈伤组织褐化研究很少，已报道的方法均是重复上述措施，如PVP、Vc以及一些醌类物质吸附剂如活性炭Ac等已被应用于组织培养，对有些植物材料，褐化得到一定的控制或减轻，对防止愈伤组织的褐化，作用甚微。一些植物材料，如暖季型草坪草，离体培养及植株再生比较困难，其中愈伤组织的褐化是影响其再生体系建立的关键和难点。特别是野牛草，最具有代表性，Hughes等(Agron Abs，Amer.soc.Agron.Madison，WI，1991，177)和Moore等(Hort.Sci.Abs，1991，26，150)从野牛草的种子和幼嫩的茎叶组织诱导出了愈伤组织，因愈伤组织褐化严重未能获得再生植株。钮友民等(杭州植物园通讯，1996，13(2)，45-46)利用野牛草“华美一号”茎段也诱导出愈伤组织，但也因愈伤组织难于继代培养，最终未得到再生植株。Fei S等(Plant Cell Org.andCult.，2000，(60)197-203；Plant Cell.Org.Cult，2001，(70)275-279，InternationalTurfgrass Society Research，1997，(8)283-289)用野牛草未成熟花序为外植体，在含9μM(2mg/L)2，4-D、5-15mg/L AgNO3及1.0g/LCH的培养基中诱导出愈伤组织，继代培养30d后，在含2.25-9μM2，4-D、0.44-1.32μM 6-BA中诱导出丛生芽，在含4.5～9μM2，4-D的培养基上诱导出胚性愈伤组织，并获得了再生植株。但培养过程愈伤组织的褐化仍未解决。其它植物材料与木本植物及禾本科植物同样存在这一问题。目前，对防止愈伤组织褐化的研究主要集中在抗氧化剂的组合利用，其依据原理是褐化由酚类物质氧化所致。黄学林等(1998)在苜蓿体胚诱导阶段加入2mmol/L多胺合成抑制剂甲基乙二醛-双(脒腙)MGBG时，乙烯释放量迅速增加，同时导致培养物严重褐化至死亡。乙烯释放量的增加是植物或组织、细胞开始衰老的重要标志，由此可推断，愈伤组织的褐化也是细胞严重衰老至死亡的表现形式。而从防止组织细胞衰老角度对愈伤组织的褐化研究未见报道。
技术实现思路
鉴于现有技术难以有效控制褐化现象产生。本专利技术从胁迫条件下细胞衰老诱使愈伤组织褐化这一全新角度进行研究，提供了一种防止愈伤组织褐化现象产生的简单易行的方法，可推广应用于其他植物外植体、愈伤组织等。本专利技术的目的是提供一种简单易行的有效控制愈伤组织褐化现象产生的方法。本专利技术是以愈伤组织为材料进行培养，以消除细胞生长至胁迫条件下衰老过程代谢产物对愈伤组织生长的反馈抑制作用为基础，确定了有效控制愈伤组织褐化的方法。本专利技术所采用的技术方案是在愈伤组织继代培养过程，通过在其继代培养基加入多胺类物质，促进细胞生长，延缓组织衰老；同时，通过在培养过程不断地使培养物所用的相对密闭容器内的代谢气态物质与无菌空气进行充分交换，消除代谢气态产物对愈伤组织生长的影响，从而有效地防止了愈伤组织的褐化，改善了愈伤组织的生长质量。本专利技术所用的愈伤组织来源于不同途径。外植体包括幼穗、叶片基部、根尖、未成熟胚及成熟胚等。诱导培养基为MS培养基、N6培养基、B5培养基或DPD培养基其中之一，培养基中碳源是蔗糖、葡萄糖其中之一或两者以任意重量比组合的混合物，所用激素为从2，4-D、6-BA和ZT的组合中选择出的任何一种、两种或三种。根据培养材料的不同，半愈期及愈伤组织诱导率分别在4～10d及80～95％。愈伤组织的生长质量也因此存在一定的差异。本专利技术在培养基中添加的多胺为精胺Spm和亚精胺Spd其中之一。添加浓度范围为Spm 1～5mg/L，Spd 1～5mg/L。添加方法为在配制培养基过程将多胺加入培养基，经117～126℃灭温后分装到培养皿或三角瓶等无菌相对密闭培养容器，待培养基冷却凝固后使用。本专利技术中愈伤组织的培养方法是将愈伤组织接到含不同浓度多胺的继代培养基中，暗培养，培养基pH值为5.5～6.2。本专利技术对培养容器内愈伤组织生长过程产生和气态代谢产物与无菌空气进行充分气体交换的方式是将愈伤组织的继代5～20d后，分别于无菌超净工作台下，打开培养皿1～3小时，使皿内与外界(无菌)气体进行充分交换后，封口继续暗培养。实施该措施的愈伤组织在同一培养基中连续培养30天以上基本不褐化，而对照培养至15～20天时，开始褐化，培养至30天，愈伤组织基本全部褐化死亡。本专利技术选优的方法步骤为，分别配制含Spm 1～3mg/L及Spd 1～3mg/L的继代培养基(基本培养为MS培养基)分装到培养皿(或其它培养容器)。将从不同途径获得的愈伤组织接到该培养基，培养至5～10天时，将培养皿(或其它培养容器)置于无菌超净工作台，打开培养皿1～2小时，保证皿内气体与外本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防止植物愈伤组织褐化现象产生的方法，其特征是将获得的愈伤组织在含有外源多胺的培养基中培养，并在培养期间间断性地用无菌空气交换相对密闭的培养容器内气态物质。包括：（１）愈伤组织的诱导，（２）愈伤组织在继代培养基培养（３）培养期间对培养容器内气态物质进行充气体交换。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙振元，钱永强，韩蕾，巨关升，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]