【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物根系遗传转化的方法，特别是涉及一种利用携带gus报告基因的载体进行根系侵染，gus染色追踪44号黑杨(populus.deltoides cl.‘danhong’×p.nigra)的遗传转化方法，属于植物基因工程。
技术介绍
1、杨树(poplar)属杨柳科(salicaceae)杨属(populus)植物，是世界上分布最广、适应性最强的树种，天然种约100多种。由于生长速度快、基因组小等特点，杨树已经成为木本植物分子生物学研究的模式材料。杨属分类系统共分为五大派，其中黑杨派具有生长快、适应性强、产量高、材质好、品种多、易杂交、易繁殖、易更新等特点，是我国栽培面积最广的杨树人工林品种，但其转化体系难以建立，已成为限制杨树基因工程育种的主要问题之一。以往黑杨遗传转化方法主要是通过叶盘法将组培苗的叶片、茎段和叶柄作为试验材料进行侵染来实现的，存在着遗传转化困难且效率低下的问题，效率多维持在10％左右。
2、随着分子生物学技术的发展，越来越多的重要功能基因被挖掘出来，但是因为杨树良种没有遗传转化体系或转化效率较低，这些重要基因很难转化目前主栽杨树品种，严重限制了分子设计育种的发展。此外，不同杨树品种之间的遗传转化体系不同，使得我们对于不同杨树品种进行遗传转化技术的探索研究具有强大的需求。现在很多杨树品种通过现有的叶盘法无法达到稳定高效的遗传转化，所以，探索一种适合黑杨遗传转化方法非常重要。
3、因此，本专利技术选用常规育种手段选育出的美洲黑杨速生良种丹红杨(p.deltoidescl.‘d
技术实现思路
1、本专利技术的目的是，针对现有技术中存在的不足，提供一种基于根系侵染后草铵膦筛选与gus染色观察的杨树遗传转化方法。
2、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：
3、一种基于根系侵染的杨树遗传转化方法，其步骤如下：
4、(1)侵染工作液的制备：
5、取携带表达载体pcambia3300的农杆菌，加入液体lb培养基，制备侵染工作液；
6、(2)侵染受体材料准备：取44号黑杨无菌组培苗，选取根系生长3-5cm左右长度未褐化的植株，去除根系上的培养基，将根系剪切成只保留根茎连接处0.2-0.5cm的根长的部分；
7、(3)根系侵染：将步骤(2)剪切好的根系直接浸泡在(1)的侵染工作液中，根系在侵染工作液中侵染10-15min；
8、(4)根系诱导生根：将侵染后的根系用滤纸吸干菌液，并将根系放入共培养基上培养，共培养结束后，直接插入生根培养基中；
9、(5)根系分化培养：将在生根培养基上生长的根系剪切成0.5-1cm小段，然后将剪切好的小段放置到分化培养基上；
10、(6)幼苗生根：待分化培养阶段产生的不定芽生长到1-2cm后，切下不定芽，放到生根培养基进行培养，得到生根的幼苗。
11、优选地，步骤(6)之后，还包括如下步骤：
12、(7)pcambia3300转化载体的gus染色鉴定。
13、优选地，所述pcambia3300转化载体的gus染色鉴定具体包括如下步骤：1)gus染液的配制；2)gus染色：将样品浸泡在gus染液中，充分没过样品，将样品放置到37℃培养箱中，过夜染色。
14、优选地，步骤(6)之后，还包括如下步骤：
15、(8)pcambia3300转化载体的鉴定。
16、优选地，所述pcambia3300转化载体的鉴定的具体步骤如下：提取对照植株44号黑杨和转入对应载体pcambia3300的转基因植株的基因组dna(ctab法)，使用引物bar-f/r，进行常规pcr扩增转入对应载体的抗除草剂(bialaphos(bar))基因序列，pcr反应体系为20μl：植株dna 1μl(200ng)，taq mix 10μl，对应引物各1μl，加水至20μl；反应程序为：95℃，6min；95℃，30sec，56℃，30sec；72℃，20sec，29个循环；72℃，6min。
17、优选地，步骤(1)中，所述液体lb培养基的配方为：卡那霉素50mg/l、利福平50mg/l。
18、优选地，步骤(1)中，所述培养条件如下：28℃，黑暗培养，200rpm，至od 600(在600nm波长处的吸光值)为0.6，取50ml菌液至50ml离心管，14℃，3500rpm，15min，弃去上清，加入重悬液重悬，至od600为0.4，完成重悬后，在重悬液中加入千分之一的100mm的乙酰丁香酮，制备成侵染工作液。
19、优选地，所述重悬液的配方见表3。
20、优选地，步骤(4)中，所述共培养基的组成见表4。
21、优选地，步骤(4)中，所述生根培养基的配方见表5，培养条件为：23-25℃光照环境下培养15-20天，直到根系生长到3-5cm。
22、优选地，步骤(5)中，所述分化培养基的配方见表6；在23-25℃、每天光照时间为14-16h的条件下进行培养，大约三周继代一次，在分化培养期间根系膨大变绿，有时也会长出少量愈伤组织，直至产生再生芽。
23、优选地，步骤(6)中，所述生根培养基的配方见表7；培养条件：在23-25℃、每天光照时间为14-16h的条件下进行培养，得到生根的幼苗。
24、有益效果：
25、1、本专利技术利用pcambia3300载体转化，利用载体上带有的gus标签，在根系侵染中能够直观有效的看到转化结果，为未来带有目的基因载体的根系侵染的转化提供实验思路和方法，具有重要的实践指导意义；
26、2、用杨树根系作为侵染材料，通过对已经具有卡纳抗性的转基因子代44号黑杨根系的成功转化，打破了转基因杨树进一步进行遗传转化难以成功或效率低下的问题，突破了转基因植株二次转化的约束性，具有重要的实践意义；
27、3、本专利技术中探索出的对草铵膦除草剂的合理浓度的使用，对已经具有卡那霉素抗性的转基因抗虫杨树进行有效的遗传转化，打破了原有黑杨叶盘法技术对草铵膦进行筛选难以获得阳性幼苗和效率低下的问题，同时通过快速分化能够缩短实验周期，并通过gus染色，实时监控，有效提高转化效率，具有重要的实践指导意义。
28、下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做进一步说明，但并不意味着对本专利技术保护的范围的限制。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其步骤如下：
2.根据权利要求1所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)之后，还包括如下步骤：(7)pCambia3300转化载体的GUS染色鉴定。
3.根据权利要求2所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：所述转基因植株的GUS染色鉴定具体包括如下步骤：1)GUS染液的配制；2)GUS染色：将样品浸泡在GUS染液中，并充分没过样品，将样品放置到37℃的环境中，过夜染色。
4.根据权利要求3所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)之后，还包括如下步骤：(8)转基因植株的PCR鉴定。
5.根据权利要求4所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：所述转基因植株的PCR鉴定的具体步骤如下：提取对照植株和转入对应载体pCambia3300的转基因植株的基因组DNA，使用引物BAR-F/R，进行常规PCR扩增侵染载体的抗除草剂基因序列，PCR反应体系为20μL：植株DNA 1μL，Taq Mix10μL，对应引物各1μL，加水至20μL；反应程序为：95
6.根据权利要求5所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(1)中，所述液体LB培养基的配方为：卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L，所述培养条件如下：28℃，黑暗培养，200rpm，至OD600为0.6，取50mL菌液至50mL离心管，14℃，3500rpm，15min，弃去上清，加入重悬液重悬，至OD600为0.4，完成重悬后，在重悬液中加入千分之一的100mM的乙酰丁香酮，制备成侵染工作液；所述重悬液的配方见表3。
7.根据权利要求6所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(4)中，所述共培养基的组成见表4，所述生根培养基的配方见表5，培养条件为：23-25℃光照环境下培养15-20天，直到根系生长到3-5cm。
8.根据权利要求7所述基于根系侵染的杨树遗传转化方法，其特征在于：步骤(5)中，所述分化培养基的配方见表6；在23-25℃、每天光照时间为14-16h的条件下进行培养，直至产生再生芽。
9.根据权利要求8所述基于根系侵染的杨树遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)中，所述生根培养基的配方见表7；培养条件：在23-25℃、每天光照时间为14-16h的条件下进行培养，得到生根的幼苗。
...【技术特征摘要】
1.一种基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其步骤如下：
2.根据权利要求1所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)之后，还包括如下步骤：(7)pcambia3300转化载体的gus染色鉴定。
3.根据权利要求2所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：所述转基因植株的gus染色鉴定具体包括如下步骤：1)gus染液的配制；2)gus染色：将样品浸泡在gus染液中，并充分没过样品，将样品放置到37℃的环境中，过夜染色。
4.根据权利要求3所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)之后，还包括如下步骤：(8)转基因植株的pcr鉴定。
5.根据权利要求4所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：所述转基因植株的pcr鉴定的具体步骤如下：提取对照植株和转入对应载体pcambia3300的转基因植株的基因组dna，使用引物bar-f/r，进行常规pcr扩增侵染载体的抗除草剂基因序列，pcr反应体系为20μl：植株dna 1μl，taq mix10μl，对应引物各1μl，加水至20μl；反应程序为：95℃，6min；95℃，30sec，56℃，30sec；72℃，20sec，29个循环；72℃、6m...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵树堂，杨松，胡建军，卢孟柱，刘颖丽，宋学勤，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：
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