一种基于根系侵染的黑杨遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，属于植物生物工程技术领域；包括：1)采用携带抗除草剂草铵膦筛选标记的表达载体的农杆菌，侵染44号抗虫黑杨带有1‑2cm茎节的无菌幼苗根系，根系剪切成只保留根茎连接处0.2‑0.5cm的根长的结构；2)将侵染后完成共培养的根系放置到含有草铵膦筛选的生根培养基上进行培养；3)将在草铵膦筛选生根培养基上生根的新生根剪切成小段，放置到含有0.8mg/L草铵膦浓度的分化培养基，分化出芽；4)将所述不定芽接种到含有草铵膦筛选的生根培养基上进行培养；5)对所述生根幼苗进行GUS染色鉴定。本发明专利技术通过对具有抗性的转基因植株进行再次草铵膦抗性表达载体的农杆菌介导转化，克服了已转基因植株再次转化难以获得阳性苗的约束性，同时缩短了黑杨转化周期至3个月，提高黑杨进行转化的效率至29.03％。本发明专利技术将为黑杨分子设计育种提供技术保障。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物根系遗传转化的方法，特别是涉及一种利用携带gus报告基因的载体进行根系侵染，gus染色追踪44号黑杨(populus.deltoides cl.‘danhong’×p.nigra)的遗传转化方法，属于植物基因工程。

技术介绍

1、杨树(poplar)属杨柳科(salicaceae)杨属(populus)植物，是世界上分布最广、适应性最强的树种，天然种约100多种。由于生长速度快、基因组小等特点，杨树已经成为木本植物分子生物学研究的模式材料。杨属分类系统共分为五大派，其中黑杨派具有生长快、适应性强、产量高、材质好、品种多、易杂交、易繁殖、易更新等特点，是我国栽培面积最广的杨树人工林品种，但其转化体系难以建立，已成为限制杨树基因工程育种的主要问题之一。以往黑杨遗传转化方法主要是通过叶盘法将组培苗的叶片、茎段和叶柄作为试验材料进行侵染来实现的，存在着遗传转化困难且效率低下的问题，效率多维持在10％左右。

2、随着分子生物学技术的发展，越来越多的重要功能基因被挖掘出来，但是因为杨树良种没有遗传转化体系或转化效率较低，这些重要基因很本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其步骤如下：

2.根据权利要求1所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)之后，还包括如下步骤：(7)pCambia3300转化载体的GUS染色鉴定。

3.根据权利要求2所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：所述转基因植株的GUS染色鉴定具体包括如下步骤：1)GUS染液的配制；2)GUS染色：将样品浸泡在GUS染液中，并充分没过样品，将样品放置到37℃的环境中，过夜染色。

4.根据权利要求3所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)之后，还包括如下步骤：(8)转基因植株的...

【技术特征摘要】

1.一种基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其步骤如下：

2.根据权利要求1所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)之后，还包括如下步骤：(7)pcambia3300转化载体的gus染色鉴定。

3.根据权利要求2所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：所述转基因植株的gus染色鉴定具体包括如下步骤：1)gus染液的配制；2)gus染色：将样品浸泡在gus染液中，并充分没过样品，将样品放置到37℃的环境中，过夜染色。

4.根据权利要求3所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：步骤(6)之后，还包括如下步骤：(8)转基因植株的pcr鉴定。

5.根据权利要求4所述基于根系侵染的黑杨遗传转化方法，其特征在于：所述转基因植株的pcr鉴定的具体步骤如下：提取对照植株和转入对应载体pcambia3300的转基因植株的基因组dna，使用引物bar-f/r，进行常规pcr扩增侵染载体的抗除草剂基因序列，pcr反应体系为20μl：植株dna 1μl，taq mix10μl，对应引物各1μl，加水至20μl；反应程序为：95℃，6min；95℃，30sec，56℃，30sec；72℃，20sec，29个循环；72℃、6m...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵树堂，杨松，胡建军，卢孟柱，刘颖丽，宋学勤，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：