一种基因技术领域的链霉菌线性质粒中抗砷基因簇。本发明专利技术整个线性质粒上抗砷基因簇共６个基因及其ＤＮＡ序列，具体为：砷抗性基因：ｓａｓＢ和ｓａｓＣ２个基因，砷抗性调节基因：ｓａｓＲ和ｓａｓＲ２２个基因，黄素单加氧酶基因：ｓａｓＯ基因，硫氧还蛋白还原酶基因：ｓａｓＴ基因；ＤＮＡ序列为序列１。本发明专利技术提供一种链霉菌ＦＲ－００８线性质粒上抗砷基因簇，所提供的基因及其蛋白质，抗体可用于环境保护，工业应用上构建新的工程菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种基因簇，特别是一种链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，属于生物技术基因领域。
技术介绍
砷化物(主要为砷酸盐和亚砷酸盐)作为重金属盐的毒害作用日益为人们所重视，由其所引起的环境问题也应起人们的广泛关注。1968年，Novick报道了金黄色葡萄球菌由质粒介导的砷抗性。1973年，Hedges等人在大肠杆菌中发现环形质粒R773对砷酸盐和亚砷酸盐具有抗性。80年代，Mobley和Chen等确定在环形质粒R773上存在一个抗砷基因操纵子，从而使抗砷基因的概念得以明确。随着研究的深入，不断有新的抗砷基因被发现，它们在介导生物体抗砷的同时，对砷的同族元素锑(Sb)也具有抗性。研究发现，革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的质粒及细菌染色质中均存在抗砷基因操纵子。革兰氏阴性菌抗砷基因操纵子有三个，分别在大肠杆菌质粒R773、质粒R46和染色质中发现。大肠杆菌质粒R773和R46含有由五个基因组成的抗砷基因操纵子，而大肠杆菌染色质仅含三个。他们的基因顺序是arsR、arsD、arsA、arsB、arsC，其功能分别为arsR编码调节蛋白，是转录抑制蛋白；arsD编码第二个转录抑制蛋白；arsA、arsB编码ATP酶结合泵，泵出亚砷酸盐；arsC编码砷酸盐还原酶，将五价砷还原为三价砷，然后泵出细胞。革兰氏阳性菌抗砷基因操纵子也有三个，可分为金黄色葡萄球菌型和枯草芽孢杆菌型两类。在金黄色葡萄球菌环形质粒pSX267和pI258中存在一个arsRBC抗砷基因簇，它们均由arsR、arsB、arsC三个基因组成，其各自功能与质粒R773相同。枯草芽孢杆菌抗砷基因操纵子，是从枯草芽孢杆菌的染色质基因组中分离出的抗砷基因操纵子，该操纵子也由arsR、arsB、arsC三个基因组成，其各自功能与质粒R773也基本相同。在酿酒酵母质粒中也存在一个抗砷基因操纵子，由三个成簇捧列的抗砷基因组成，分别是ACR1、ACR2和ACR3。ACR1是ACR3的正向(顺式)调节基因。ACR2编码一个砷还原酶蛋白，可以将五价砷还原为三价砷，作用与ArsC相似。ACR3基因受ACR1基因正向调节，编码一个氧阴离子转运通道，作用与细菌ArsB相似。ACR3蛋白锚定在细胞膜上有10个跨膜区，与ArsB不同的是它没有ATP酶结合位点。它捧出亚砷酸盐的能量是利用化学渗透作用。当高浓度的砷化物存在时，ACR基因可以介导对砷化物的抗性。这些砷抗性基因都是位于细菌染色质或环形质粒中，在线形质粒，以及产生抗生素的土壤微生物链霉菌中没有发现砷抗性基因存在。具有抗砷基因的细菌也显示出在环境保护方面的应用价值。在细胞内融合表达ArsR，与没有过量表达ArsR相比，细胞内的砷酸盐浓度提高了5-60倍。ArsR对砷的高亲和性，能够从污染了50ppb亚砷酸盐的水中，完全将砷除去。利用抗砷基因赋予宿主砷抗性，可以避免砷对在同时伴有砷污染的环境进行生物治理的工程菌的的毒性，提高其相应的环境治理能力。目前，抗砷基因只局限于上述几种微生物中，这些基因只能在近缘的宿主间转移，因此，丰富抗砷基因的来源，可以赋予多种生物治理工程菌的砷抗性，扩大其应用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足和需要解决的技术问题，提供一种链霉菌线性质粒中抗砷基因簇。本专利技术使这种链霉菌FR-008的sas抗砷基因簇代表了链霉菌中所特有的抗砷基因簇的组成和基因捧列方式，并且可用于环保和一些工程菌的创新和发展。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术整个线性质粒上抗砷基因簇共6个基因及其DNA序列，具体为砷抗性基因sasB和sasC 2个基因，砷抗性调节基因sasR和sasR2 2个基因，黄素单加氧酶基因sasO基因，硫氧还蛋白还原酶基因sasT基因；DNA序列为序列1。所述的6个基因及其DNA序列编码相应抗砷功能蛋白的氨基酸序列，即序列2-7；包括包含序列1中碱基1-375的基因sasR2，包含序列1中碱基424-1,494的基因sasO，包含序列1中碱基1,491-2,603的基因sasB，包含序列1中碱基2,600-2,884的基因sasR，包含序列1中碱基3,004-3,426的基因sasC，包含序列1中碱基3,423-4,397的基因sasT，编码了调节蛋白，亚砷酸转运蛋白，黄素依赖的单加氧酶，砷酸还原酶，硫氧还蛋白还原酶，并提供这些基因所编码酶的氨基酸序列。所述的抗砷基因，其编码亚砷酸转运蛋白和砷酸还原酶，即sasB和sasC的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。所述的砷抗性的调节基因，即sasR和sasR2的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。编码黄素单加氧酶基因，即sasO的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。编码硫氧还蛋白还原酶基因，参与砷酸还原酶催化五价砷还原成为三价砷，即sasT的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序列。所述的序列1的互补序列可依据DNA碱基互补原则随时得到，序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用限制性内切酶酶切DNA得到。所述的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本专利技术序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法，从Streptomyces ceolicolor A3(2)，Streptomyces sp.F2得到与链霉菌FR-008线性质粒抗砷基因簇同源的基因。所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过转导、转化、接合转移的方法转入外源宿主，这些外源宿主包括链霉菌，大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物，动物和工程菌中，并在外源宿主中表达，赋予宿主亚砷酸盐和砷酸盐抗性。所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆DNA可用来通过转导、转化、接合转移的方法转入工程菌中，通过调节抗砷基因簇的表达，应用细菌除去砷污染物，达到环境保护的目的。所述的核苷酸序列可被修饰或突变，修饰或突变的途径包括插入或置换，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，或通过紫外线或化学试剂突变。本专利技术所提供的氨基酸序列可以用来分离需要的蛋白质并可以用于抗体制备，本专利技术所提供的基因及其蛋白质，抗体可用于环境保护，工业应用上构建新的工程菌。所涉及的核苷酸序列或部分序列的基因或基因簇在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能，所涉及的氨基酸序列或部分序列的多肽可能在去除或替代某个或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化蛋白动力学特征。附图说明图1链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇的组成图和缺失部分抗砷基因的抗砷性质图1中上半部分显示链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇，包含sasR2，sasO，sasB，sasR，sasC，和sasT这一系列共6个基因和位于这些基因上的部分限制性酶切位点，以及链霉菌FR-008线性质粒上抗砷基因簇突变体缺失序列，显示缺失序列1中从sas R2起始密码子上游34bp处NruI位点到sasT终止密码子下游532bp处的PmaCI位点之间4962个碱基，包括了链霉菌FR-008线性质粒上整个抗砷基因簇，被1.4kb的阿泊拉霉素抗性基因替代。下半部显示8个包含序列1中不同区域的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种链霉菌线性质粒中抗砷基因簇，其特征在于，整个线性质粒上抗砷基因簇共６个基因及其ＤＮＡ序列，具体为：砷抗性基因：ｓａｓＢ和ｓａｓＣ２个基因，砷抗性调节基因：ｓａｓＲ和ｓａｓＲ２ ２个基因，黄素单加氧酶基因：ｓａｓＯ基因，硫氧还蛋白还原酶基因：ｓａｓＴ基因；ＤＮＡ序列为序列１。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓子新，王连荣，陈实，由德林，周秀芬，肖湘，黄曦，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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