新的O-超家族芋螺毒素肽，其编码多核苷酸及用途制造技术

本发明专利技术涉及新的Ｏ－超家族芋螺毒素肽（Ｏ－Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ，Ｏ－ＣＴＸ），编码所述肽的多核苷酸，含有该多核苷酸的构建体和转化细胞，以及重组生产所述肽的方法。本发明专利技术还涉及所述芋螺毒素肽的人工合成和用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的O-超家族芋螺毒素肽、其编码多核苷酸及用途，属于生物

技术介绍
芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺(Conus)分泌出来的，用于麻醉猎物的小肽类毒素。它们是由6-41个氨基酸残基组成的，富含半胱氨酸(Cys)的动物神经肽毒素。其毒性极大，可引起动物出现惊厥、颤抖、甚至麻痹死亡。芋螺毒素的化学结构新颖，生物活性强，作用靶位的选择性高。既可直接用作天然药物，又可作为药物设计的先导化合物。鉴于其分子小、结构稳定、对受体作用范围大、特异性强、可化学合成；又是基因表达的产物，还可在体外重组表达获得较大量毒素。每种芋螺毒液中有约50-200种不同的芋螺毒素(Conotoxin，CTX)，且不同芋螺种类的毒素肽互不相同，不同的芋螺毒素在生物体内的作用靶位完全不同，至少有几万种芋螺毒肽具有调节各种离子通道的特殊功能，从而组成了一系列的神经药物源。食虫芋螺毒素对多种蠕虫有致死作用，可开发为多肽杀虫剂，或转化植物培育抗虫作物新品种。因此，芋螺毒素已跃居动物神经毒素研究的首位，成为药理学和神经科学的有力工具和新药开发的新来源，引起了全世界科学家们的广泛重视。我国芋螺资源丰富，是我国海南特有的药用海洋生物，绝大多数芋螺种类的毒素研究尚未开展，我国更应加紧开展具有自主知识产权的芋螺毒素基因资源的研究开发工作，对海洋制药工业具有特别重要的意义。本
技术实现思路
正是适应当前海洋药物芋螺毒素研究的发展趋势和需要而取得的，具有广阔的应用前景。根据芋螺毒素作用于生物体内的不同靶位可分为3类(1)作用于电压门控离子通道的CTX，电压门控离子通道又称电压敏感性通道，常以通透离子(如Na+，K+，Ca2+等)命名。(2)作用于配体门控离子通道的CTX，包括烟碱受体、5HT3受体、NMDA受体。配体门控通道又称化学门控通道或递质依赖性通道，后者按相应的受体命名。(3)作用于其他受体的CTX，CTX除了作用于离子通道以外，还有以G-蛋白为靶标的，如芋螺加压素和芋螺惰性素，以及2种磷脂(conodipineM和PLA2)，它们基本上不含有二硫键。按其作用的受体靶可将芋螺毒素分为α、ω、μ、δ等多种亚型。根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族。每个超家族根据受体靶类型，又可分为α、αA、κA(A-超家族)，ω、δ、κ、μO(O-超家族)，μ、ψ、KM(M-超家族)等家族(亚型)(见表1，引自J.Michael McIntosh，et al.CONUS PEPTIDES TARGETED TOSPECIFIC NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR SUBTYPES.AnnualReview of Biochemistry.1999，(68)59-88.)与受体有关的过程是生命调节过程中的重要环节，受体蛋白的研究鉴定，与具有特异作用和高亲和性结合能力的毒素密切相关。芋螺毒素通过与神经和肌肉细胞膜多种受体(钠通道、钙通道和乙酰胆碱受体等)特异性结合，影响与受体有关的一系列细胞调节过程，使受体研究从推测分析水平进入阐明分子机理水平，成为神经科学研究鉴定受体及其调控细胞活动分子机理的重要工具，并在顽痛、癫痫症、心脏血管疾病、精神病、运动失调、痉挛、癌症、艾滋病、神经保护、中风等疑难杂症的治疗中显示出诱人的应用前景。多种芋螺毒素已进入临床试验(见表2，引自LAURA NELSON.Venomous snailsOne slip，andyou′re dead....Nature，2004，429798-799). 表1 芋螺毒素超家族 表2 处于不同临床试验阶段的芋螺毒素 O-超家族芋螺毒素(半胱氨酸模式C-C-CC-C-C)主要作用于电压门控离子通道(又称电压敏感性通道)，包括Ca2+离子通道、Na+离子通道和K+离子通道等。Ca2+通道为所有兴奋性细胞膜的必要成分之一，分为L，T，N，P和Q类型，其中N类型的Ca2+通道只存在于神经元组织(如脊椎动物的中枢神经系统以及外周神经系统)，它主要抑制神经递质尤其是去甲肾上腺素从交感神经上释放时Ca2+的进入。作用于Ca2+通道的CTX只有ω-CTX。ω-CTX G VI A从地纹芋螺中提取的，含有27个氨基酸、3个二硫键，属于O超家族。它是选择性抑制N类型Ca2+通道的毒素。MVIIA是从幻芋螺中提取的ω-CTX，也是首次进入临床试验的神经Ca2+通道拮抗剂.ω-芋螺毒素MVIIA，用于癌症、爱滋病晚期的顽痛治疗，成本比鸦片类止痛剂大大降低，它比常用麻醉药强万倍以上，是珍贵的海洋药物.ω-芋螺毒由于能特异作用于多种类型的钙离子通道，并具有严格的生物活性特异性而受到神经生物学家和药理学家的重视，成为研究鉴定钙离子通道的有效工具药，同时在特异诊断试剂和新药研制开发方面也具有潜在的应用前景。以Na+离子通道为靶标的有μ-CTX、μO-CTX和δ-CTX。其中μ-CTX的半胱氨酸模式与μO-CTX和δ-CTX的不同，前者属于M超家族，后两者属于O超家族。以K+离子通道为靶标的有κA-CTX和κ-CTX。κ-CTX属于O超家族。Na+和K+通道是研究神经信号的重要途径，与之相结合的芋螺毒素在神经科学研究和新药开发领域的应用潜力巨大。虽然已有多个O超家族的芋螺毒素肽被发现，但进行深入研究的不多。绝大多数海南产的芋螺毒素急待研究与开发。本专利技术针对的正是现有技术中的这一需求，对我国乃至世界海洋制药将具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术基于的是从我国海南产的大理石芋螺(Conus marmoreusLinnaeus)、幻芋螺(Conus magus Linnaeus)、信号芋螺(Conuslittertus Linnaeus)、勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)、独特芋螺(Conus caracteristicus Fischer)、帝王芋螺(Conus ImperialisLinnaeus)、织锦芋螺(Conus textile Linnaeus)、桶形芋螺(Conusbetulinus Linnaeus)、疣蒿芋螺(Conus lividus Hwass)等共12个种中分别发现的具有药用功能的O-超家族芋螺毒素肽(O-superfamilyConotoxin，O-CTX)。因此，本专利技术在一个方面提供了新的O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX)。本专利技术在另一方面提供了编码所述肽的多核苷酸。本专利技术还提供了含有所述多核苷酸的核酸构建体，含有该核酸构建体的表达载体，以及被所述核酸构建体或表达载体转化了的细胞。本专利技术还提供了所述肽的人工合成与重组制备方法。本专利技术中发现，所述芋螺毒素肽对蟑螂、棉铃虫、烟青虫、水稻螟虫、甘蔗螟虫、荔枝椿象等害虫有致死作用。因此，本专利技术的芋螺毒素可作为多肽杀虫剂开发。其基因可用于转化微生物(例如昆虫杆状病毒、大肠杆菌和酵母等)和植物，开发出新型生物农药，培育出抗虫作物新品种。本专利技术的芋螺毒素肽可通过结合电压门控离子通道发挥作用，电压门控离子通道又称电压敏感性通道，包括Ca2+离子通道、Na+离子通道、K+离子通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｏ－超家族芋螺毒素肽，其包含选自下组的氨基酸序列：　　　　（１）ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１－３５中任一所示的氨基酸序列；　　　　（２）ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３６－７０中任一所示的氨基酸序列；　　　　（３）与上述（１）或（２）中任一所示的氨基酸序列至少８０％、优选至少８５％、更优选至少９０％、尤其优选至少９５％、最优选至少９７％相同的氨基酸序列；或　　　　（４）因１－５个、优选１－３个、更优选１－２个、最优选１个氨基酸残基的取代、缺失、插入和／或添加而与上述（１）或（２）中任一所示的氨基酸序列有所不同的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗素兰，长孙东亭，张本，林秋金，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：66[中国|海南]